【摘 要】
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目的:探究乏氧炎症微环境下自噬对hPDLCs（human periodontal ligament cells,人牙周膜成纤维细胞）中PD-L1（programmed cell death 1 ligand 1,程序性死亡配体-1）的表达调控作用。方法:（1）原代培养hPDLCs,将hPDLCs分别在常氧、乏氧、炎症、乏氧炎症微环境下培养24h,利用Western Blot、流式细胞术、激光共聚焦
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目的:探究乏氧炎症微环境下自噬对hPDLCs（human periodontal ligament cells,人牙周膜成纤维细胞）中PD-L1（programmed cell death 1 ligand 1,程序性死亡配体-1）的表达调控作用。方法:（1）原代培养hPDLCs,将hPDLCs分别在常氧、乏氧、炎症、乏氧炎症微环境下培养24h,利用Western Blot、流式细胞术、激光共聚焦检测hPDLCs中PD-L1的表达情况。（2）将hPDLCs在乏氧炎症微环境下分别培养0h,1h,3h,6h,12h,24h。利用Western Blot及激光共聚焦检测hPDLCs中PD-L1的表达随时间的改变。（3）将hPDLCs在乏氧炎症微环境下分别培养0h,1h,3h,6h,12h,24h。利用Western Blot检测hPDLCs中自噬相关蛋白p62/SQSTM1和LC3的表达随时间的改变。（4）将hPDLCs在乏氧炎症微环境下分别培养0h,12h,24h。利用透射电镜观察hPDLCs中自噬体和自噬溶酶体的形成。（5）利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤及自噬增强剂雷帕霉素对hPDLCs进行预处理,结合Real-time PCR、Western Blot、流式细胞术及激光共聚焦等分子生物学技术手段,探究乏氧炎症微环境下自噬对hPDLCs中PD-L1的表达调控作用。结果:（1）乏氧炎症微环境下hPDLCs中PD-L1的表达量显著低于单一的炎症微环境（Western Blot结果:P<0.05;流式细胞术结果:P<0.05;平均荧光强度:P<0.01）。（2）乏氧炎症微环境下,hPDLCs中PD-L1的表达量从0h到12h逐渐上升（Western Blot结果:P<0.001;平均荧光强度:P<0.001）,在12h时PD-L1表达量达到最大;在乏氧炎症微环境下,hPDLCs中PD-L1的表达量从12h到24h逐渐下降（Western Blot结果:P<0.05;平均荧光强度:P<0.001）。（3）乏氧炎症微环境下,hPDLCs中LC3-II/LC3-I的比值从1h到12h逐渐上升（Western Blot结果:P<0.01）,并且从12h到24h维持在较高水平。乏氧炎症微环境下,hPDLCs中p62的表达量从0h到3h逐渐上升（Western Blot结果:P<0.05）,从3h到24h以时间依赖的方式逐渐下降（Western Blot结果:P<0.01）。（4）hPDLCs在乏氧炎症微环境下培养12h及24h,透射电镜可以观察到自噬体及自噬溶酶体的形成。（5）乏氧炎症微环境下,3-甲基腺嘌呤预处理的hPDLCs中PD?L1的表达水平显著上调（Real-time PCR结果:P<0.001;Western Blot结果:P<0.05;平均荧光强度:P<0.01）;雷帕霉素预处理的hPDLCs中PD?L1的表达水平显著下调（Real-time PCR结果:P<0.01;Western Blot结果:P<0.05;平均荧光强度:P<0.01）;流式细胞分析显示,3-甲基腺嘌呤预处理的hPDLCs中PD-L1的表达呈上调的趋势,雷帕霉素预处理的hPDLCs中PD-L1的表达显著下调（P<0.01）。结论:本研究发现乏氧炎症微环境下hPDLCs中PD-L1的表达量显著低于单一的炎症微环境,自噬对hPDLCs中PD-L1的表达有负调控作用。
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