背景与目的:谷氨酸诱导的兴奋毒性过程被认为与中风、癫痫、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化等重大神经系统疾患的发生发展有关,而离子型谷氨酸受体——N-甲基-D-门冬氨酸受体( N-methyl-D-asparate receptor, NMDAR)在此过程中起最主要的作用。人们试图通过干预谷氨酸兴奋毒性损伤过程中的不同环节来实现神经保护与损伤修复的目的,但结果均不尽人意。抗兴奋毒性研究急需找到新的靶点。在这种情况下,一个可望产生神经保护与神经发生调控双重效应的新的重要靶点便是血清诱导激酶(serum-inducible kinase, Snk)-树突棘相关的Rap特异性GTPase活化蛋白( spine-associated Rap guanosine triphosphatase (GTPase) activating protein, SPAR)途径对兴奋性突触传递中树突棘的调控。兴奋性谷氨酸能突触的突触后结构约有90%位于树突棘上,树突棘构成了哺乳动物中枢神经系统兴奋性突触传递的原始位点,是学习和记忆活动的生物学基础。SPAR位于树突棘的突触后致密区(postsynaptic density, PSD)中,与NMDAR与脚手架蛋白PSD-95组成复合体,是调节活动依赖性突触重构的重要蛋白之一,并与树突棘的成熟及形态的维持密切相关。近来发现,神经元活化时,被诱导产生的Snk可以使SPAR蛋白磷酸化和降解,最终导致树突棘结构的失稳定。因此,Snk-SPAR信号途径可能会通过调控树突棘的稳定性在一定或较大程度上参与中枢神经系统兴奋毒性损伤过程,然而目前我们对此领域还一无所知。银杏叶提取物是一种含有黄酮类和萜内酯等多种活性成分的混合物,具有抗氧化和清除自由基、抑制由缺血引起的神经细胞凋亡、抑制和消除β淀粉样蛋白(β-amyloid)的聚积、影响神经递质转运等功能,临床上已广泛应用于治疗中风、记忆力减退、痴呆以及其他动脉闭塞性疾病,但其相关的作用机制却仍未完全阐明。本课题的目的在于观察谷氨酸诱导大鼠海马神经元兴奋毒性损伤与Snk-SPAR途径之间的关系,并研究兴奋毒性过程中银杏叶提取物EGb761对Snk-SPAR途径的干预及其对树突棘形态的调节作用,不仅探讨了银杏叶提取物抗兴奋毒性神经保护作用的分子机制,更可望为神经保护/神经发生调控提供新的策略和手段。方法:对体外培养18d的原代大鼠海马神经元给予终浓度100μM谷氨酸和10μM甘氨酸,采用台盼蓝染色、荧光TUNEL及LDH检测方法,观察谷氨酸对神经元的损伤情况。在谷氨酸诱导兴奋毒性损伤模型中,通过RT-PCR方法检测Snk/SPAR在mRNA水平的表达变化,蛋白质免疫印迹方法观察Snk/SPAR在蛋白质水平的表达变化。用EGb761和MK-801预处理海马神经元,通过台盼蓝染色、荧光TUNEL和LDH检测法观察EGb761和MK-801对海马神经元兴奋毒性损伤的保护效应,并通过RT-PCR、蛋白质免疫印迹、荧光原位杂交和双重荧光标记的方法,分别在mRNA和蛋白质水平观察EGb761和MK-801预处理对谷氨酸刺激后所诱导的海马神经元中Snk/SPAR的表达水平及分布变化的影响。通过海马神经元绿色荧光蛋白质粒转染的方法观察EGb761和MK-801预处理对谷氨酸兴奋毒性模型中神经元树突棘损伤的保护作用。结果:一.谷氨酸诱导的大鼠海马神经元兴奋毒性损伤中Snk/SPAR表达水平的变化(一)体外培养18d的原代大鼠海马神经元加入100μM谷氨酸和10μM甘氨酸处理10min,18h后检测神经元死亡率为35%,凋亡率为37.2%,损伤程度是正常组的3.1倍。(二)神经元基础状态下Snk mRNA水平较低,经100μM谷氨酸和10μM甘氨酸处理10min后,1h即可出现表达水平升高,6h达高峰,约为基础水平的4.2倍,随后逐渐下降,12h左右回到基线水平。而基础状态下SPAR mRNA水平较高,当谷氨酸刺激后,随着Snk mRNA表达水平的增高而表达减少,到6h达到最低,约为基础水平的34%,此后逐渐恢复。(三)在蛋白质水平,Snk在正常神经元中很难被检测到,而SPAR表达丰富。谷氨酸刺激后3h,Snk的表达开始缓慢增强,一直持续到36h达最高峰,约是基础水平的3.3倍,此后开始下降;与mRNA水平一致,谷氨酸刺激后,SPAR的变化趋势与Snk相反,但变化的幅度大于前者,至谷氨酸刺激后36h已基本检测不到。二.银杏叶提取物EGb761抗谷氨酸兴奋毒性作用中Snk-SPAR途径机制探讨(一)在谷氨酸诱导海马神经元兴奋毒性损伤中,EGb761与MK-801预处理均有神经元保护作用。EGb761和MK-801预处理组神经元与谷氨酸组神经元相比,死亡率分别降低了31.4%和67.8%,凋亡率分别降低了37.8%和68.2%,LDH漏出量分别降低了32.6%和60.6%。(二)谷氨酸刺激后6h,EGb761与MK-801预处理组同谷氨酸组相比,Snk mRNA水平分别下降了约39%和46%,而SPAR mRNA水平上升了约47%和65%。(三)谷氨酸刺激后36h,EGb761和MK-801预处理组的Snk水平比谷氨酸组分别降低了48.7%和52.5%,而SPAR水平也分别上升到了正常组的66.1%和72.4%。(四)EGb761与MK-801预处理可以对谷氨酸诱导兴奋毒性过程中神经元突起上Snk分布增多及其所导致的SPAR分布减少有明显的阻断作用。(五)谷氨酸诱导的兴奋毒性作用对海马神经元的树突棘结构有明显的损伤作用,表现为树突棘的退化消失、树突干的静脉曲张样改变等,树突棘的数量比正常组减少了约70.5%,而EGb761与MK-801预处理可以明显改善谷氨酸对树突棘的损伤情况,与谷氨酸组相比,树突棘的数量分别增长了56.7%和60.6%。结论:一.谷氨酸诱导的兴奋毒性损伤可以导致Snk/SPAR在mRNA和蛋白质水平的表达变化,提示谷氨酸兴奋毒性过程与Snk-SPAR途径密切相关。二.EGb761预处理给药有显著的抗谷氨酸兴奋毒性作用,但此作用不如MK-801明显。三.在谷氨酸兴奋毒性过程中,无论在mRNA水平还是蛋白质水平,EGb761预处理给药可以明显干预Snk/SPAR表达水平的变化,并对谷氨酸刺激所导致的Snk/SPAR的在神经元上的分布变化有显著影响,提示EGb761抗兴奋毒性作用机制与调节Snk-SPAR途径的信号传递有关。四.谷氨酸诱导的兴奋毒性作用对海马神经元的树突棘结构有明显的损伤作用,可能与激活Snk-SPAR途径有关。五.EGb761预处理可以明显改善谷氨酸对树突棘的损伤情况,其维持树突棘正常的形态和结构作用的分子机制可能与调节Snk-SPAR途径有关。