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目的:研究表观遗传酶DOT1L在脓毒症中的粒/单核细胞的炎症反应中的调控机制。方法:第一部分:1.筛选LPS刺激诱导小鼠骨髓Gr1+粒/单核细胞中表达改变的表观遗传酶。取12只健康小鼠,随机分配为实验组与对照组,剥离小鼠股骨和胫骨冲洗获得骨髓细胞,应用Ficoll法获得小鼠骨髓单个核细胞,再应用磁珠分选术获取小鼠骨髓Gr1+粒/单核细胞,实验组予LPS刺激造成脓毒症模型。2h后收取两组的细胞,应用Q-PCR检测组蛋白修饰酶:EZH2、G9A、MLL1、LSD1、ASH1、JMJD3、DOT1L。2.测定人外周血粒/单核细胞脓毒症模型中的组蛋白及修饰酶的表达。选取2020年6月至2020年12月在苏州大学附属儿童医院泌尿外科拟行包皮环切术的健康儿童12例,其中6例作为LPS实验组,另6例作为对照组,对外周静脉血应用裂红液处理后,再应用磁珠分选技术获得CD11b+粒/单核细胞,体外予LPS刺激造成脓毒症模型,利用QPCR检测组蛋白修饰酶:JMJD3、DOT1L;利用流式细胞仪检测H3K79me2的变化。3.验证脓毒症患者外周血中粒/单核细胞比例及组蛋白水平的变化。选取2020年6月至2020年12月在苏州大学附属儿童医院重症医学科住院并确诊为脓毒血症患儿6例,以及健康儿童6例作为对照组。对患儿外周静脉血经裂红液去除红细胞后获得人外周血白细胞,以CD11b+作为鉴定总粒/单核细胞的标志物,应用流式细胞术检测脓毒症患者粒/单核细胞比例及组蛋白H3K79me2。4.测定抑制DOT1L后小鼠骨髓粒/单核细胞脓毒症模型炎症因子。取12只健康小鼠,随机分配为实验组与对照组,实验组小鼠骨髓粒/单核细胞应用DOT1L的小分子抑制剂SGC0946预处理后使用LPS刺激粒/单核细胞2h。收取细胞进行QPCR检测炎症因子:IL-6、IL-12、iNOS、NOX2、IL-10。第二部分:1.测定脓毒症小鼠骨髓粒/单核细胞群体比例和功能。通过对小鼠腹腔内注射脂多糖（LPS）（20mg/kg）建立脓毒血症模型,对照组腹腔注射等量的生理盐水,实验组分别在2/24/72h取脓毒症小鼠骨髓细胞,并按照注射LPS后的时间分组,应用流式细胞仪检测不同时间点的粒/单核细胞比例;应用磁珠分选术分选出72h组骨髓Gr1+粒/单核细胞,再次予LPS刺激,2小时后收取细胞,Q-PCR检测炎症因子:IL-6、iNOS,IL-12。2.测定脓毒症小鼠骨髓造血c-kit+前体细胞中DOT1L及转录因子表达。通过对小鼠腹腔内注射脂多糖（LPS）建立脓毒血症模型（20mg/kg）,对照组腹腔注射等量的生理盐水,实验组分别在2/24/72h取脓毒症小鼠骨髓细胞,并按照注射LPS后的时间分组,应用磁珠分选获取小鼠骨髓c-kit+造血前体细胞,Q-PCR检测造血前体细胞中DOT1L和转录因子GFI-1、C/EBPα、PU1的表达。结果:第一部分:1.LPS刺激诱导小鼠骨髓中粒/单核细胞DOT1L的表达下调。与对照组相比,LPS组小鼠骨髓粒/单核细胞中的组蛋白甲基化酶EZH2、G9A、MLL1的表达水平无明显变化,LSD1、ASH1无法检测到;JMJD3显著上调（P＜0.05）,DOT1L表达水平显著下调（P＜0.05）。2.LPS刺激诱导健康人外周血CD11b+粒/单核细胞中DOT1L显著下调。与对照组相比,LPS组人粒/单核细胞中组蛋白甲基化酶JMJD3显著上调（P＜0.05）,LPS组人粒/单核细胞中组蛋白甲基化酶DOT1L亦显著下调（P＜0.05）。3.LPS刺激诱导健康人外周血CD11b+粒/单核细胞中H3K79me2蛋白水平显著下调。与对照组相比,LPS组的人外周血粒/单核细胞中DOT1L的下游催化产物H3K79me2蛋白水平亦显著下降（P＜0.05）。4.脓毒症患者外周血CD11b+粒/单核细胞中H3K79me2水平下调。与健康对照组相比,脓毒症患者组外周CD11b+粒/单核细胞细胞的核内染色结果显示CD11b+粒/单核细胞中DOT1L催化产物H3K79me2表达下降（P＜0.05）,而外周CD11b+粒/单核细胞细胞比例显著升高（P＜0.05）。5.DOT1L的小分子抑制剂SGC0946增强小鼠粒/单核细胞炎症因子的表达。与对照组相比,使用DOT1L的小分子抑制剂SGC0946预处理正常小鼠骨髓粒/单核细胞24小时后的处理组（SGC）在LPS刺激2小时后,炎症因子IL-6、IL-12和iNOS的表达显著升高（P＜0.05）,NOX2及IL-10mRNA水平无显著变化。第二部分1.脓毒症小鼠骨髓中粒/单核细胞群体比例升高。分别取LPS诱导脓毒症后的2/24/72小时的小鼠骨髓细胞,与对照组相比,在2h时骨髓中Gr1+粒/单核细胞比例较对照组下降,并处于最低水平,然而随时间不断升高,至72小时已显著高于对照组（P＜0.05）。2.脓毒症小鼠骨髓新产生的粒/单核细胞群体具有潜在促炎功能。与未处理组相比,利用LPS诱导脓毒症达72小时的小鼠的骨髓粒/单核细胞再次接受体外LPS刺激后,测得炎症因子IL-6和iNOS-mRNA表达水平进一步明显升高（P＜0.05）,而IL-12-mRNA始终处于高表达水平。3.脓毒症小鼠c-kit+造血前体细胞中DOT1L表达下调,同时粒/单核细胞谱系分化发育转录因子表达上调。与对照组相比,LPS诱导脓毒症的小鼠2/24/72小时的骨髓中c-kit+造血前体细胞中DOT1L随着时间改变显著下调（P＜0.05）,同时,粒系转录因子PU.1随时间发展无明显变化,但粒系转录因子GFI-1和C/EBPα随时间改变显著上调（P＜0.05）。结论:脓毒症中,DOT1L通过两个层面调控机体粒/单核细胞免疫应答:一、DOT1L在成熟粒/单核细胞遇到病原体刺激后表达下调并导致H3K79me2表达下调,导致多种炎症因子和效应因子如IL-6,IL-12,iNOS等大量产生和释放,进一步加重组织损伤;二、DOT1L在造血干/前体细胞向髓系分化时表达下调,同时粒/单核转录因子GFI-1、C/EBPα等的上调,促进炎症诱导的外周粒/单核细胞的持续补给,加剧炎症反应。