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目的
通过建立人脑胶质瘤耐药株T98G细胞裸鼠异位移植模型，探讨白藜芦醇(Resveratrol，RV)对替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)抗胶质瘤作用的影响及其与Wnt/β-catenin信号通路之间的关系。
方法
1.培养T98G胶质瘤细胞，并建立脑胶质瘤裸鼠异位移植模型，模型建立后将36只雄性裸鼠随机分为6组：溶剂对照(DMSO)组；白藜芦醇(RV)组；替莫唑胺(TMZ)组；RV+TMZ组；RV+TMZ+Wnt抑制剂IWR-1组；RV+TMZ+Wnt激活剂氯化锂(Licl)组。模型建立5天后，对实验裸鼠进行腹腔注射给药处理：DMSO组(含有0.1％DMSO的生理盐水)；RV组，10mg/(kg/d)；TMZ组，25mg/(kg/d)；RV+TMZ联合用药组(剂量与单独给药组一致)；RV+TMZ+IWR-1组[RV,TMZ与单独给药组剂量一致；IWR-1，5mg/(kg/d)]；RV+TMZ+Licl组[RV,TMZ与单独给药组剂量一致；Licl，2mg/(kg/d)]；以上六组连续给药25天。
2.每间隔5天测量一次肿瘤生长体积，并用游标卡尺测量移植瘤的长径(a)及与之垂直的短径(b)，计算肿瘤体积(V＝a×b2×0.5)。实验过程中密切观察各组裸鼠生存状况并做记录。待给药25天后将裸鼠麻醉处死，取出肿瘤标本，并根据肿瘤体积的改变绘制出肿瘤生长曲线。
3.采用苏木素伊红染色法观察六组肿瘤细胞的大体形态。
4.采用TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡状况。
5.采用免疫荧光检测六组肿瘤组织中MGMT(O6-methylguanine-DNA Meth yltrans-ferase,MGMT)和β-catenin的表达。
6.蛋白免疫印迹法(Western blot)检测六组肿瘤组织中包括WNT2、β-catenin、GSK3β和MGMT在内的蛋白表达，并比较组间差异。
结果
1.人脑胶质瘤耐药株T98G细胞裸鼠异位移植模型成功建立。
2.根据裸鼠肿瘤体积改变，绘制出肿瘤体积生长曲线图，比较六组肿瘤体积大小，RV组、RV+TMZ组、RV+TMZ+IWR-1组和RV+TMZ+Licl组的肿瘤体积与DMSO组相比较小，差值具有统计学意义(P＜0.05)。尽管RV组和DMSO组相比肿瘤体积有所减小，但应用统计分析后数值无显著性差异(P＝0.062)。而TMZ组与RV+TMZ+Licl组相比数值差异不显著(P＝0.354)。六组中RV+TMZ+IWR-1组的体积最小。与RV+TMZ组相比，RV+TMZ+IWR-1组肿瘤体积减小，RV+TMZ+Licl组肿瘤体积增大，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
3.HE染色观察细胞形态
HE染色结果发现胶质瘤细胞呈栅栏状坏死。DMSO组和RV组，胶质瘤细胞呈现出不同的形状，包括圆形、梭形或多边形；细胞核大，染色质丰富，间质可见大量微血管结构，核分裂与异源性很常见。TMZ组、RV+TMZ组、RV+TMZ+IWR-1组和RV+TMZ+Licl组中，胶质瘤细胞较少，体积较小，梭形细胞较多；微血管结构小于DMSO组，核分裂较少。
4.TUNEL染色观察凋亡率
与DMSO组相比，TMZ组、RV+TMZ组、RV+TMZ+IWR-1组和RV+TMZ+Licl组的细胞凋亡率显著升高(P＜0.05)。而RV组的细胞凋亡率与DMSO组相比无显著性差异(P＝0.441)。与另外5组相比RV+TMZ+IWR-1组细胞凋亡率明显增加。而RV+TMZ+Licl组与RV+TMZ组相比细胞凋亡率明显降低(P＜0.05)；与TMZ组相比RV+TMZ+Licl组的细胞凋亡率有所升高(P＝0.057)。
5.免疫荧光对MGMT和β-catenin定性分析
与DMSO组相比，RV组、RV+TMZ组和RV+TMZ+IWR-1组MGMT和β-catenin的免疫荧光强度降低。TMZ组和RV+TMZ+Licl组在这方面没有显著差异。然而，与RV+TMZ组相比，RV+TMZ+IWR-1组MGMT和β-catenin的免疫荧光强度降低，而RV+TMZ+Licl组，MGMT和β-catenin的免疫荧光强度升高。
6.蛋白免疫印迹结检测各组中Wnt2、β-catenin、GSK-3β及MGMT的表达
与DMSO组相比，RV组、RV+TMZ组和RV+TMZ+IWR-1组中Wnt信号通路蛋白Wnt2和β-catenin表达降低，MGMT表达下调，GSK-3β表达上调(P＜0.05)。与DMSO组相比TMZ组和RV+TMZ+Licl组中Wnt信号通路的Wnt2和β-catenin表达降低，MGMT表达下调，GSK-3β表达上调但经过统计分析后结果没有显著差异(P＞0.05)。然而，在RV+TMZ+IWR-1组Wnt信号通路相关基因(Wnt2和β-catenin)的表达相对较低，MGMT表达也相对较低，而GSK-3β表达升高(P＜0.05)。与RV+TMZ组相比，RV+TMZ+Licl组中Wnt信号通路相关基因(Wnt2和β-catenin)和MGMT的表达均升高，但GSK-3β表达是降低的(P＜0.05)。
结论
1.白藜芦醇能显著增强替莫唑胺对人脑胶质瘤耐药株T98G细胞裸鼠异位移植瘤生长的抑制能力。
2.白藜芦醇通过降低Wnt2、β-catenin的表达水平使经典Wnt信号通路受到抑制，进而导致MGMT表达下降。
3.白藜芦醇能降低胶质瘤对替莫唑胺的耐药性，增强其抗肿瘤作用。
通过建立人脑胶质瘤耐药株T98G细胞裸鼠异位移植模型，探讨白藜芦醇(Resveratrol，RV)对替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)抗胶质瘤作用的影响及其与Wnt/β-catenin信号通路之间的关系。
方法
1.培养T98G胶质瘤细胞，并建立脑胶质瘤裸鼠异位移植模型，模型建立后将36只雄性裸鼠随机分为6组：溶剂对照(DMSO)组；白藜芦醇(RV)组；替莫唑胺(TMZ)组；RV+TMZ组；RV+TMZ+Wnt抑制剂IWR-1组；RV+TMZ+Wnt激活剂氯化锂(Licl)组。模型建立5天后，对实验裸鼠进行腹腔注射给药处理：DMSO组(含有0.1％DMSO的生理盐水)；RV组，10mg/(kg/d)；TMZ组，25mg/(kg/d)；RV+TMZ联合用药组(剂量与单独给药组一致)；RV+TMZ+IWR-1组[RV,TMZ与单独给药组剂量一致；IWR-1，5mg/(kg/d)]；RV+TMZ+Licl组[RV,TMZ与单独给药组剂量一致；Licl，2mg/(kg/d)]；以上六组连续给药25天。
2.每间隔5天测量一次肿瘤生长体积，并用游标卡尺测量移植瘤的长径(a)及与之垂直的短径(b)，计算肿瘤体积(V＝a×b2×0.5)。实验过程中密切观察各组裸鼠生存状况并做记录。待给药25天后将裸鼠麻醉处死，取出肿瘤标本，并根据肿瘤体积的改变绘制出肿瘤生长曲线。
3.采用苏木素伊红染色法观察六组肿瘤细胞的大体形态。
4.采用TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡状况。
5.采用免疫荧光检测六组肿瘤组织中MGMT(O6-methylguanine-DNA Meth yltrans-ferase,MGMT)和β-catenin的表达。
6.蛋白免疫印迹法(Western blot)检测六组肿瘤组织中包括WNT2、β-catenin、GSK3β和MGMT在内的蛋白表达，并比较组间差异。
结果
1.人脑胶质瘤耐药株T98G细胞裸鼠异位移植模型成功建立。
2.根据裸鼠肿瘤体积改变，绘制出肿瘤体积生长曲线图，比较六组肿瘤体积大小，RV组、RV+TMZ组、RV+TMZ+IWR-1组和RV+TMZ+Licl组的肿瘤体积与DMSO组相比较小，差值具有统计学意义(P＜0.05)。尽管RV组和DMSO组相比肿瘤体积有所减小，但应用统计分析后数值无显著性差异(P＝0.062)。而TMZ组与RV+TMZ+Licl组相比数值差异不显著(P＝0.354)。六组中RV+TMZ+IWR-1组的体积最小。与RV+TMZ组相比，RV+TMZ+IWR-1组肿瘤体积减小，RV+TMZ+Licl组肿瘤体积增大，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
3.HE染色观察细胞形态
HE染色结果发现胶质瘤细胞呈栅栏状坏死。DMSO组和RV组，胶质瘤细胞呈现出不同的形状，包括圆形、梭形或多边形；细胞核大，染色质丰富，间质可见大量微血管结构，核分裂与异源性很常见。TMZ组、RV+TMZ组、RV+TMZ+IWR-1组和RV+TMZ+Licl组中，胶质瘤细胞较少，体积较小，梭形细胞较多；微血管结构小于DMSO组，核分裂较少。
4.TUNEL染色观察凋亡率
与DMSO组相比，TMZ组、RV+TMZ组、RV+TMZ+IWR-1组和RV+TMZ+Licl组的细胞凋亡率显著升高(P＜0.05)。而RV组的细胞凋亡率与DMSO组相比无显著性差异(P＝0.441)。与另外5组相比RV+TMZ+IWR-1组细胞凋亡率明显增加。而RV+TMZ+Licl组与RV+TMZ组相比细胞凋亡率明显降低(P＜0.05)；与TMZ组相比RV+TMZ+Licl组的细胞凋亡率有所升高(P＝0.057)。
5.免疫荧光对MGMT和β-catenin定性分析
与DMSO组相比，RV组、RV+TMZ组和RV+TMZ+IWR-1组MGMT和β-catenin的免疫荧光强度降低。TMZ组和RV+TMZ+Licl组在这方面没有显著差异。然而，与RV+TMZ组相比，RV+TMZ+IWR-1组MGMT和β-catenin的免疫荧光强度降低，而RV+TMZ+Licl组，MGMT和β-catenin的免疫荧光强度升高。
6.蛋白免疫印迹结检测各组中Wnt2、β-catenin、GSK-3β及MGMT的表达
与DMSO组相比，RV组、RV+TMZ组和RV+TMZ+IWR-1组中Wnt信号通路蛋白Wnt2和β-catenin表达降低，MGMT表达下调，GSK-3β表达上调(P＜0.05)。与DMSO组相比TMZ组和RV+TMZ+Licl组中Wnt信号通路的Wnt2和β-catenin表达降低，MGMT表达下调，GSK-3β表达上调但经过统计分析后结果没有显著差异(P＞0.05)。然而，在RV+TMZ+IWR-1组Wnt信号通路相关基因(Wnt2和β-catenin)的表达相对较低，MGMT表达也相对较低，而GSK-3β表达升高(P＜0.05)。与RV+TMZ组相比，RV+TMZ+Licl组中Wnt信号通路相关基因(Wnt2和β-catenin)和MGMT的表达均升高，但GSK-3β表达是降低的(P＜0.05)。
结论
1.白藜芦醇能显著增强替莫唑胺对人脑胶质瘤耐药株T98G细胞裸鼠异位移植瘤生长的抑制能力。
2.白藜芦醇通过降低Wnt2、β-catenin的表达水平使经典Wnt信号通路受到抑制，进而导致MGMT表达下降。
3.白藜芦醇能降低胶质瘤对替莫唑胺的耐药性，增强其抗肿瘤作用。