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狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染引起的一种古老的急性、高致死性人兽共患病。全球平均每年仍有大约55,000人死于狂犬病,我国是狂犬病的高发区。狂犬病病毒属于弹状病毒科狂犬病病毒属成员,具有强烈的嗜神经性,一旦发病病死率几乎为100%。疫苗免疫是目前防治狂犬病最为有效的方法。但目前的疫苗存在免疫程序复杂、免疫后抗体产生迟缓,抗体维持时间短等缺点,亟待研制新型狂犬病疫苗。9型腺相关病毒(Adeno-associated virus type 9,AAV9)为细小病毒家族依赖病毒属的缺陷型病毒,其作为基因工程疫苗载体具有安全性高、可持续表达外源基因等优点,具有极低的免疫原性和毒性的同时,穿透血脑屏障的能力较强。本研究将狂犬病病毒主要保护性抗原G蛋白基因重组至9型腺相关病毒,获得重组腺相关病毒rAAV9-GFP-RABVG。通过体外细胞实验、动物免疫及攻毒保护实验,分析G蛋白表达情况,评价其免疫原性和保护性。目的1.采用9型腺相关病毒作为载体,插入狂犬病病毒SRV9毒株G蛋白基因,构建表达狂犬病病毒G蛋白的重组腺相关病毒rAAV9-GFP-RABVG。2.通过体外细胞实验检测rAAV9-GFP-RABVG在细胞水平上能否表达RABV G蛋白;通过动物免疫实验检测rAAV9-GFP-RABVG的免疫原性和保护性,为新型重组狂犬病疫苗的研制提供科学依据。方法1.构建表达狂犬病病毒G蛋白的9型腺相关病毒载体重组病毒rAAV9-GFP-RABVG,体外感染293T细胞,通过间接免疫荧光实验和Western blot检测狂犬病病毒G蛋白的表达情况。2.6-8周龄雌性BALB/c小鼠后肢骨骼肌注射rAAV9-GFP-RABVG,监测小鼠体重、饮食、毛色状态,持续21天,通过小鼠体重变化及小鼠状态初步评价重组病毒疫苗的安全性。3.6-8周龄雌性BALB/c小鼠后肢骨骼肌注射rAAV9-GFP-RABVG,在免疫后第2、4、8、12、24周采血,分离外周血清,利用荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测病毒中和抗体(VNA)效价,获得中和抗体的持续期和消长变化规律。4.通过流式细胞术检测rAAV9-GFP-RABVG诱导小鼠募集和/或活化B、T、DCs细胞的情况。5.使用ELISpot检测试剂盒检测特异性刺激物存在时rAAV9-GFP-RABVG诱导小鼠脾细胞分泌细胞因子IFN-y和IL-4的能力。6.使用ELISA试剂盒检测特异性刺激物存在时rAAV9-GFP-RABVG诱导小鼠脾细胞分泌IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的水平。7.攻毒保护实验。6-8周龄雌性BALB/c小鼠后肢骨骼肌注射rAAV9-GFP-RABVG后21天,异侧后肢骨骼肌注射HuPBN3株狂犬病病毒,记录攻毒后21天内小鼠状态及死亡情况,取死亡小鼠脑组织进行RT-PCR,检测rAAV9-GFP-RABVG能否保护小鼠免于狂犬病病毒致死剂量的攻击。结果1.间接免疫荧光及Western blot实验检测到狂犬病病毒G蛋白在细胞水平上的表达,且分子量约为70kD,与预期大小相符。2.与空白组和AAV9-GFP对照组相比,rAAV9-GFP-RABVG重组病毒组小鼠体重变化轻微,未出现异常行为或神经症状。3.对免疫小鼠血清中和抗体水平检测结果显示,与对照组AAV9-GFP相比,rAAV9-GFP-RABVG能诱导小鼠产生强烈的RABV中和抗体,免疫后2周达到13.66IU/ml,第8周达到峰值,且免疫后24周仍保持较高水平。4.流式细胞术结果显示,与空白组和AAV9-GFP对照组相比,rAAV9-GFP-RABVG能诱导小鼠募集和/活化更多的B细胞(CD19+CD40+双阳性)和DCs(CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+MHC Ⅱ+双阳性)细胞,小鼠脾中抗原特异性分泌IFN-γ和IL-4的CD4+T细胞和抗原特异性分泌IFN-γ的CD88+细胞显著增多。5.IFN-γ ELISpot和IL-4 ELISpot检测结果趋势相似,与空白组和AAV9-GFP对照组相比,rAAV9-GFP-RABVG刺激小鼠脾淋巴细胞产生的斑点形成细胞(SFCs)数目显著增多。6.ElISA结果显示,与空白组和AAV9-GFP对照组相比,rAAV9-GFP-RABVG诱导小鼠脾细胞抗原特异性分泌的IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ显著增多。7.攻毒保护实验结果显示,攻毒后观察期结束时空白组及AAV-GFP对照组的小鼠出现典型狂犬病症状,且存活率均为0%。rAAV9-GFP-RABVG重组病毒组小鼠观察期内未出现任何狂犬病症状,观察期结束时组内小鼠存活率为100%。空白组和AAV9-GFP对照组死亡小鼠脑组织的RT-PCR结果显示,死亡小鼠死于狂犬病。结论1.成功构建了表达狂犬病病毒G蛋白的重组腺相关病毒rAAV9-GFP-RABVG。2.rAAV9-GFP-RABVG在小鼠体内可触发针对狂犬病病毒的特异性免疫应答,诱导产生强烈的体液和细胞免疫反应,为小鼠提供了完全保护力抵抗狂犬病病毒致死性的攻击,证明该重组病毒具有新型狂犬病候选疫苗的潜力。