抗肿瘤药物对机体正常细胞的细胞毒性及肿瘤细胞多药耐药性机制始终是抗肿瘤治疗的主要障碍。抗肿瘤靶向药物虽然有较低的细胞毒性和可选择性杀伤肿瘤细胞的作用,但多数靶向药物通常基于肿瘤细胞与正常细胞间差异性抗原研制,故在肿瘤细胞发生抗原漂移和抗原调变时常使抗肿瘤靶向药物的疗效减弱,甚至失去疗效。在探索抗肿瘤治疗途径过程中,人们发现热疗法可在不伤害机体正常细胞的情况下选择性杀伤肿瘤细胞,而且还可通过热诱导作用使肿瘤细胞的免疫原性增强,从而有助于机体免疫系统对肿瘤细胞的识别,进而增强机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用。然而,单纯依靠热疗方法进行抗肿瘤治疗,存在疗效低、治疗不彻底等缺点,因此热疗法通常与其它抗肿瘤治疗方法联合使用。热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)是高度保守的细胞蛋白质家族之一,肿瘤热疗、化疗等因素都可诱导产生热休克蛋白。HSPs可通过多肽结合阈与肿瘤细胞内不同的肿瘤相关抗原结合形成复合物并激活免疫系统。有研究表明,肿瘤细胞内HSPs水平显著高于正常组织细胞；在肿瘤细胞膜表面可检测到HSPs,而相同条件下正常细胞膜表面却检测不到HSPs。但是,肿瘤细胞经热诱导后细胞膜表面蛋白水平是否存在规律性变化以及能否用于抗肿瘤治疗鲜见报道。为此,本研究首先考察经热诱导后人肝癌Hep G2细胞膜表面蛋白水平是否存在规律性变化。由于HSP70是肿瘤细胞膜表面的主要热诱导蛋白,故先采用流式细胞术等方法对热诱导后Hep G2细胞膜表面HSP70水平的动态变化情况进行研究。在此基础上,采用经热诱导的Hep G2细胞免疫BALB/c小鼠,通过免疫学和基因工程的方法构建单链抗体文库,然后利用核糖体展示和免疫亲和筛选方法,获得与热诱导后Hep G2细胞结合的特异性单链抗体,进而构建特异性单链抗体重组免疫毒素基因并对其表达的融合蛋白特异性、亲和性以及抗肿瘤活性进行检测。研究显示Hep G2细胞膜表面HSP70水平在42℃热诱导后37℃恢复培养12h出现峰值,同时细胞膜表面可检测到HSP70的细胞百分数显著增加(由7.85%增加到15.11%)。采用核糖体展示技术成功筛选获得与热诱导后Hep G2细胞结合的特异性单链抗体克隆(scfv5669和scfv5670),进而成功构建单链抗体重组免疫毒素(scfv5669-seb).分析显示：scfv5669-seb融合蛋白保有单链抗体和金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白的结构和空间构象,不与入正常肝细胞系L-02细胞结合,对热诱导后Hep G2细胞特异性、亲和性及肿瘤生长抑制率显著高于未经热诱导的Hep G2细胞(P<0.05)。综上可见,热诱导后Hep G2细胞膜表面HSP70水平随时间延长而增加,达峰值后随时间延长而降低并趋于恢复到热诱导前水平。热诱导后恢复培养期间,Hep G2细胞膜表面HSP70水平出现峰值时,细胞膜表面可检测到HSP70的细胞百分数显著增加(P<0.05)。以此为基础,成功获得与热诱导后Hep G2细胞结合的特异性单链抗体克隆(scfv5669和scfv5670)并成功构建单链抗体重组免疫毒素(scfv5669-seb)。经实验检测scfv5669-seb表达融合蛋白具有较好的特异性、亲和性和抗肿瘤活性。本研究为利用热诱导后Hep G2细胞膜表面蛋白水平规律性变化构建新型抗肿瘤免疫毒素、协同肿瘤热疗提供依据。