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马立克病（Marek’s Disease,MD）是由α疱疹病毒引起的以淋巴细胞增生为主要特征的疾病,因其高致死率对全球家禽业的经济影响巨大。因此,探寻与马立克病发生、发展过程中相关的分子及其作用和机制,将为进一步探明MD的发生机制提供理论基础,并为临床有效防控提供实验依据。转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）通过影响细胞凋亡、细胞增殖等过程从而在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用,其在肿瘤发生发展中的调控作用受到了越来越多的关注,但是鸡TGF-β1在MD肿瘤发生发展过程中的调控作用及其机制尚不完全明确。MDCC-MSB1是鸡马立克病毒（Marek’s Disease Virus,MDV）诱导产生的T淋巴细胞增生性肿瘤细胞系之一,含有MDV基因组,是研究疱疹病毒相关肿瘤的理想模型。因此,本研究以MDCC-MSB1为模型,在过表达和抑制表达鸡TGF-β1的基础上,研究鸡TGF-β1对MDCC-MSB1细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学特性的影响。从胞内和胞外两条途径探究通过检测鸡TGF-β1过表达和抑制表达对MDCC-MSB1细胞中TGF-β1/Smad2信号通路关键信号分子与增殖、凋亡相关分子表达相关性的影响,以探究鸡TGF-β1可通过TGF-β1/Smad2信号通路调控MDCC-MSB1细胞增殖、凋亡的机制,为进一步探究鸡TGF-β1在MDV感染鸡肿瘤发生中的作用和机制奠定基础,主要内容如下:1.鸡TGF-β1原核表达及抗体制备根据Gen Bank中鸡TGF-β1序列和pET-32a（+）载体序列,构建pET-32a-TGF-β1原核表达载体,然后将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导条件的优化与诱导表达,通过SDS-PAGE电泳检和Western blot检测鸡TGF-β1表达情况。然后将表达的鸡TGF-β1纯化后免疫Balb/c小鼠以制备鸡TGF-β1多克隆抗体。结果显示,成功构建了pET-32a-TGF-β1原核表达载体,与pET-32a质粒转化菌相比,在1 mmol/L IPTG、温度37℃、诱导6 h的最佳诱导表达条件下,pET-32a-TGF-β1重组质粒阳性菌可表达1条大小约65 KD以包涵体形式表达的蛋白。采用ELISA及间接免疫荧光法检测纯化蛋白免疫小鼠产生的多克隆抗体具有高度的特异性。2.鸡TGF-β1抑制表达载体和过表达载体的构建及表达检测通过Gen Bank中鸡TGF-β1（NM-001318456.1）序列与载体pDC316-mCMV-Zs Green和pG1.2载体多克隆位点,构建pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1过表达载体和pG1.2-Gallus-TGF-β1干扰表达载体。然后将过表达质粒pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1、干扰表达质粒pG1.2-Gallus-TGF-β1及其相应空载体对照（NC）转染MDCC-MSB1细胞,于转染后48 h,采用倒置荧光显微镜观察、荧光定量PCR和Western blot检测细胞内鸡TGF-β1的表达情况。结果显示,转染后48 h,在倒置荧光显微镜下可以观察到黄绿色荧光信号,与TGF-β1过表达NC组相比,过表达质粒pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1组MDCC-MSB1细胞中鸡TGF-β1的mRNA表达和蛋白表达均显著升高（P＜0.05）;与TGF-β1干扰表达NC组相比,干扰表达质粒pG1.2-Gallus-TGF-β1组MDCC-MSB1细胞中鸡TGF-β1的mRNA表达和蛋白表达均显著降低（P＜0.05）。3.鸡TGF-β1对MDCC-MSB1细胞生物学特性影响采用CCK-8、流式细胞术、Transwell等实验方法检测各组细胞的生物学特性。CCK-8法检测结果显示,与其相应NC对照组相比,在转染后24 h、48 h、72 h,过表达质粒pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1组MDCC-MSB1细胞的增殖水平均显著降低（P＜0.05）,干扰表达质粒pG1.2-Gallus-TGF-β1组MDCC-MSB1细胞的增殖水平均显著升高（P＜0.05）。细胞周期检测结果显示,与其相应NC组相比,过表达质粒pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1组MDCC-MSB1细胞的G1期细胞分布显著升高（P＜0.05）,S期细胞分布显著降低（P＜0.05）,G2期细胞分布无差异,干扰表达质粒pG1.2-Gallus-TGF-β1组MDCC-MSB1细胞的G1期细胞分布显著降低（P＜0.05）,S期细胞分布无差异,G2期细胞分布显著增加（P＜0.01）。细胞凋亡检测结果显示,与其相应NC组相比,过表达质粒pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1组细胞凋亡显著增加（P＜0.01）,干扰表达质粒pG1.2-Gallus-TGF-β1组细胞凋亡无显著差异。迁移、侵袭能力检测结果显示,与其相应NC组相比,过表达质粒pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1组MDCC-MSB1细胞的迁移、侵袭均显著下降（P＜0.05）,干扰质粒pG1.2-Gallus-TGF-β1组MDCC-MSB1细胞的迁移、侵袭均显著增加（P＜0.05）。4.鸡TGF-β1通过TGF-β1/Smad2通路调控MDCC-MSB1细胞增殖、凋亡的机制研究采用荧光定量PCR和Western blot检测细胞TGF-β1/Smad2通路相关分子及增殖、凋亡相关分子mRNA表达和蛋白表达。荧光定量PCR结果显示,过表达质粒pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1组与TGF-β1过表达NC组相比,MDCC-MSB1细胞中TGF-β1、Smad2、Cyt-c、Caspase-3、Caspase-9的mRNA表达均显著升高（P＜0.05）,Bcl-2、β-catenin的mRNA表达均显著降低（P＜0.05）,TGF-β1蛋白因子组与空白对照组相比和过表达质粒pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1组与TGF-β1过表达NC组相比的结果具有一致性;干扰表达质粒pG1.2-Gallus-TGF-β1组与TGF-β1干扰表达NC组相比,MDCC-MSB1细胞中TGF-β1、Smad2、Cyt-c、Caspase-3、Caspase-9的mRNA表达均显著降低（P＜0.05）,Bcl-2、β-catenin的mRNA表达均显著升高（P＜0.05）,SB431542组与空白对照组相比和干扰表达质粒pG1.2-Gallus-TGF-β1组与TGF-β1干扰表达NC组相比的结果具有一致性。Western blot结果显示,与TGF-β1过表达NC组相比,过表达质粒pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1组MDCC-MSB1细胞中TGF-β1、Cyt-c、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达均显著升高（P＜0.05）,p-Smad2/Smad2比值显著升高（P＜0.05）,Bcl-2、β-catenin蛋白表达均显著降低（P＜0.05）,TGF-β1蛋白因子组与空白对照组相比和过表达质粒pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1组与TGF-β1过表达NC组相比的结果具有一致性;与TGF-β1干扰表达NC组相比,干扰表达质粒pG1.2-Gallus-TGF-β1组MDCC-MSB1细胞中TGF-β1、Cyt-c、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达均显著降低（P＜0.05）,p-smad2/Smad2比值显著降低（P＜0.05）,Bcl-2、β-catenin蛋白表达均显著升高（P＜0.05）,SB431542组与空白对照组相比和干扰表达质粒pG1.2-Gallus-TGF-β1组与TGF-β1干扰表达NC组相比的结果具有一致性。综上所述,鸡TGF-β1可抑制MDCC-MSB1细胞增殖、迁移与侵袭,促进其凋亡。鸡TGF-β1可通过TGF-β1/Smad2信号通路调控MDCC-MSB1细胞增殖与凋亡。本研究将为探究鸡TGF-β1在MD肿瘤发生、发展中的作用和机制奠定基础。