甲状腺癌是最常见的内分泌系统的恶性肿瘤(>90%),甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma, PTC)是甲状腺癌最常见的病理类型,其发病率呈上升趋势。最近报道Sonic hedgehog通路激活与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关,与甲状腺乳头状癌的关系尚有待证实。本研究拟对Sonic hedgehog信号通路中启动因子Shh蛋白(有学者亦称之为“音猥因子”)为主要研究对象,构建携带Shh基因慢病毒载体,转染人甲状腺乳头状癌原代细胞,稳定过表达Shh蛋白；构建Sonic hedgehog信号传导通路级联反应的启动信号过表达模型,检测通路中主要位点基因及蛋白表达变化规律,检测甲状腺乳头状癌细胞体外生物学性状影响。明确干预Sonic hedgehog通路对甲状腺乳头状癌细胞的影响,以期阐明Sonic hedgehog信号转导通路在甲状腺乳头状癌发生、发展中作用及信号转导机制,研究结果将为甲状腺乳头状癌病因机制研究提供新思路,并为其治疗提供新的可能性靶点。1甲状腺乳头状癌组织中Shh和Glil的表达及其临床意义研究目的：通过检测Sonic Hedgehog信号通路关键分子Shh和Gli1在甲状腺乳头状癌表达情况,探讨其与甲状腺乳头状癌临床病理特征的关系及临床意义。方法：应用免疫组织化学方法检测142例甲状腺乳头状癌患者癌组织及其癌旁组织病理蜡块标本中Shh和Gli1的表达情况,分析其与临床病理特征的关系。结果：Shh主要表达于细胞膜与细胞浆中,Gli1表达于细胞浆和细胞核内。甲状腺乳头状癌组织中Shh和Gli1阳性表达率分别为64.1%(91/142)和47.9%(68/142)明显高于癌旁组织的16.9%(24/142)和9.2%(13/142)。Gli1的表达与患者年龄有关(P<0.05)。Shh和Gli1与肿瘤的TNM分期显著相关(P<0.01)。Shh和Gli1在肿瘤长径≥1cm的表达阳性率分别为79.2%和60.4%,均高于肿瘤长径<1cm的表达阳性率,差异均具有统计学意义,Shh更为显著(P<0.01)。Shh和Gli1在有淋巴结转移的PTC组织中的表达阳性率分别为72.5%和65.2%,差异有统计学意义,Gli1更为显著(P<0.01)。结论：Sonic hedgehog信号通路的主要配体Shh和Gli1在甲状腺乳头状癌中表达升高,并与肿瘤发生、分期及淋巴结转移有关,提示Sonic hedgehog信号通路的异常激活在甲状腺乳头状癌中发挥一定的作用,Shh和Gli1做为甲状腺乳头状癌预后判断指标及可能存在的治疗靶点。2人甲状腺乳头状癌原代细胞的体外长期培养目的：探索人甲状腺乳头状癌原代细胞的体外长期培养方法及其监测鉴定手段。方法：常规分离甲状腺乳头状癌细胞,并用含有10%胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和20ng/ml人重组表皮生长因子(EGF)的高糖型DMEM培养液培养,分别在不同时间观察甲状腺乳头状癌细胞生长情况,测定培养液中的甲状腺球蛋白(Tg)和甲状腺过氧化物酶(TPO)水平,用免疫细胞化学方法检测Tg。结果：培养约8d甲状腺乳头状癌细胞长满约80%的培养瓶底,符合传代标准；在培养约45d内生长良好；经5-6次传代后细胞逐渐老化。细胞培养液中Tg含量随培养时间延长呈抛物线形表达,培养约14d Tg达到峰值(985.2μg/L); TPO在细胞培养液中始终没有检测到。免疫荧光染色结果显示体外培养甲状腺乳头状癌原代细胞的甲状腺球蛋白表达阳性。结论：应用该研究建立的培养条件可以使人甲状腺乳头状癌原代细胞传5-6代,细胞存活约45d。建立了简便、系统的监测及鉴定甲状腺乳头状癌细胞生物活性手段,提示在14d左右该细胞用于基因研究较为合适,为研究甲状腺乳头状癌发生发展机制及其特征提供一种合适替代工具。3 Shh基因在PTC细胞表达情况与慢病毒感染PTC细胞实验目的：了解PTC细胞中Shh基因表达和慢病毒感染PTC细胞的能力,为进一步的基因干预实验提供依据。方法：收集生长状态良好的目的细胞,提取RNA,并反转录成cDNA,应用Real-timePCR及Western blotting技术检测目的基因人Shh和Tg的表达情况,以PTC原代细胞、结肠癌RKO细胞系、结肠癌HCT116细胞系、前列腺癌PC-3细胞系样品的cDNA为模板,用Shh和Tg基因的引物和GAPDH引物分别扩增目的基因和内参基因：采用96孔板每孔中8000个细胞,当日加入慢病毒,三天拍照；以PTC原代细胞为目的细胞,293T细胞为阳性对照。运用加入病毒感染试剂Polybrene,不同剂量配比等方法,探索PTC原代细胞慢病毒转染条件,并进行检测及模型评价。结果：目的细胞充分表达Tg基因,确为PTC细胞。PTC原代细胞少量表达Shh基因,表达丰度无法满足检测实验要求。前列腺癌PC-3细胞表达Shh基因,表达丰度能满足检测实验要求,符合文献报道,表明Real-time PCR预实验的结果可靠。PTC原代细胞可以被pGC-FU-LV慢病毒载体感染,最佳条件下为含有5ug/ml Polybrene病毒感染试剂的Eni.S感染增强培养基,在上述条件下达到80%的感染效率需要的MOI约为20。结论：PTC原代细胞少量表达Shh基因,表达丰度无法满足检测实验要求,不适合进一步使用基因沉默技术干预Shh基因表达；但PTC原代细胞可以被pGC-FU-LV慢病毒载体感染,为进一步慢病毒载体稳定转染PTC细胞提供依据。4人Shh基因重组过表达慢病毒载体的构建与鉴定目的：构建人Shh基因过表达慢病毒载体,转染293T细胞,建立稳定转染人Shh基因的293T的细胞系。方法：设计引物引入Age I酶切位点,使用PCR方法从质粒中扩增Shh基因的编码区序列,对所扩增出的目的片段回收纯化。用In-Fusion技术将Age I内切酶消化后目的片段交换连接入Age I酶切的pGC-FU载体,构建Shh慢病毒表达载体pGC-FU-Shh。酶切验证并测序正确后,将质粒pGC-FU-Shh与携带GFP的慢病毒辅助包装载体共转染293T细胞,荧光显微镜检测慢病毒载体转染细胞的结果,重组质粒pGC-FU-Shh的测序,Western blotting验证Shh在转染293T细胞中表达。结果：转染293T细胞后荧光显微镜,24h后观察到绿色荧光蛋白的表达,基本判断Shh表达,说明转染成功。重组质粒pGC-FU-Shh的测序Shh基因片段大小1386bp。通过Western blotting检测转染293T的样品,可以观察到72～95KDa处有条特征带,其大小和Shh融合蛋白(～51KDa+28KDa=79KDa)相吻合,基本判断Shh表达。通过PCR扩增获得了Shh基因,将Shh克隆到慢病毒转移质粒pGC-FU中,并在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒。结论：成功构建了pGC-FU-Shh-GFP慢病毒过表达载体,获得了稳定转染的细胞株。人Shh基因过表达慢病毒载体成功构建和稳定转染293T细胞系的建立为进一步体外研究的功能奠定了基础。5慢病毒转染后稳定过表达Shh对PTC细胞体外生物学性状影响的研究目的：观察慢病毒载体pGC-FU-Shh-GFP转染并稳定过表达Shh蛋白后对PTC原代细胞体外生物学性状影响,探讨Shh通路在PTC原代细胞中的作用及可能的信号转导机制。方法：在建立慢病毒载体pGC-FU-Shh-GFP转染PTC原代细胞,稳定过表达Shh蛋白模型基础上,设立转染实验组和阴性对照组。应用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,Transwell实验检测细胞迁移能力,以及Real-time PCR及Western blotting技术检测PTCH、SMO、Gli1基因的：mRNA及蛋白表达情况,同时与阴性对照组检测结果进行比较。结果：与阴性对照组比较,Shh稳定过表达后,PTC原代细胞细胞表现出了较强的细胞增殖能力；使细胞周期G1期、S期相对阴性对照组增高,PTC细胞增殖较快；PTC细胞的迁移运动能力明显增强；Shh通路中关键基因表达变化为基因PTCH、SMO、Gli1蛋白表达水平明显提高。结论：通过慢病毒载体pGC-FU-Shh-GFP转染方法,稳定过表达Shh蛋白,成功激活PTC原代细胞Sonic hedgehog信号传导通路；甲状腺乳头状癌的发生、发展中Sonic hedgehog通路激活是激发或促进因素,Sonic hedgehog信号转导通路可能促进肿瘤细胞的生长、转移。