目的：　　 铝（aluminium，Al）在生活中接触十分频繁。它是非必需的微量元素之一。据WHO报道，含铝的食品添加剂是人民大众铝暴露的主要途径。饮食中铝的来源有四个方面，包括饮水，天然食物，含铝食品添加剂及铝制炊具、容器。20世纪70年代前认为，铝与铝盐是不被人体所吸收的，无急慢性毒性。70年代中期以来，国内外学者对铝的毒性展开深入研究后认为:铝的过度接触和体内蓄积可对神经系统造成损害。在许多人类神经系统疾病中，如透析性脑病、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默症等，均发现CNS中存在异常的铝积聚现象。最近的研究表明，脑铝与β淀粉样蛋白有联系。β淀粉样蛋白可以大大削弱海马的长时程增强。尽管除了透析性脑病，铝是否就是这些疾病的病因还存有争议，但提升剂量确实能诱发或加重病理过程。提示，铝很可能是智力低下性神经疾病的一个重要的环境致病因子。　　 当前，铝对于学习记忆能力的损害作用及其机制是神经毒理学研究的一个热点问题。海马是学习记忆的关键部位。海马长时程增强(Long-term potentiation，LTP)是脑学习记忆功能在突触水平的研究模型和细胞基础，是公认的研究学习记忆的电生理模型。LTP的诱导与维持都与学习记忆能力紧密相关，其中晚期长时程增强(late-phase LTP, L-LTP)与长时记忆密切相关，其维持需要新的基因转录和蛋白质合成。cAMP-PKA-CREB信号转导途径对于L-LTP的维持至关重要，在学习记忆的信号传导中发挥重要作用。铝可对LTP的维持期造成损害，但相关机制并不明确。　　 本研究采用亚慢性经口染铝（AlCl3水溶液）的方式，建立亚慢性AlCl3暴露导致记忆能力受损的动物模型（从子代大鼠出生后立即给予AlCl3染毒，连续3个月）。本实验以仔鼠为研究对象，运用病理学、神经行为学、电生理学、生物化学和分子生物学多种技术手段，从血和脑内的铝含量、海马神经元和突触的病理形态改变、动物神经行为学改变、海马CA1区L-LTP的诱导和维持、细胞内游离Ca2+浓度，细胞内信号转导通路（受体-G蛋白-AC-cAMP-PKA-CREB通路），以及基因表达等多角度探讨不同剂量水平铝暴露对于学习记忆功能的危害，进一步探讨相关机制。　　 方法：　　 由中国医科大学实验动物中心提供的Wistar大鼠60只，体重260±10g，雌雄比例2∶1。实验动物室温度17～23℃，相应湿度45～55％，动物饲料由实验动物中心提供。随机将雌鼠分为对照组和低、中、高剂量AlCl3组，然后将雌雄大鼠按2∶1同笼进行交配，次日晨发现阴栓或阴道分泌物镜检有精子者定为受孕，记为妊娠第0d。子代大鼠刚出生后记做出生第1d，并立即给予AlCl3染毒。对照组孕鼠在产子后饮用蒸馏水，低、中、高剂量AlCl3组孕鼠在产子后分别饮用0.2％、0.4％、0.6％ AlCl3蒸馏水溶液。各染铝组仔鼠在断乳前经由吸吮母乳染铝，断乳后则通过自行饮水摄铝，至出生后3个月结束，然后进行各项指标测定。　　 采用原子吸收光谱法测定仔鼠血液和海马组织铝含量，称量体重及脏器系数，采用跳台实验、穿梭箱实验和Morris水迷宫实验测定仔鼠的学习记忆能力，采用HE染色法观察仔鼠海马神经细胞形态，采用透射电镜技术观察仔鼠海马组织神经元和神经突触超微结构，采用细胞外微电极记录技术检测染铝动物大鼠海马CAl-CA3途径L-LTP的诱导和维持情况，采用Fura-2荧光探针法测定细胞内游离Ca2+浓度，采用放射免疫法(RIA)测定各组仔鼠海马组织中cAMP浓度，采用免疫印迹(Westem blot)法测定各组仔鼠海马组织中PKA和c-Jun蛋白含量，采用免疫组织化学法测定各组仔鼠海马组织中胞核内磷酸化CREB含量、胞浆内BDNF蛋白含量，采用RT-PCR法测定各组仔鼠海马BDNF mRNA表达水平，采用免疫荧光组化染色技术测定各组仔鼠海马组织中BDNF蛋白含量，并用激光共聚焦扫描显微镜观察和摄片。　　 结果：　　 一、AlCl3对大鼠记忆能力和海马超微结构的影响　　 1、不同剂量铝暴露对仔鼠体重、海马及脑系数等的影响　　 各剂量组仔鼠的体重与对照组相比呈现不同程度的降低趋势。各剂量组的海马系数、脑系数和海马/脑比值与对照组相比均呈现不同程度的升高趋势。　　 2、各组仔鼠血液和海马组织中铝含量测定　　 染铝各组仔鼠的血铝浓度均显著高于对照组(P＜0.01)，且随着铝暴露剂量的增加，血铝浓度呈现一定的升高趋势;脑铝的变化趋势与血铝一致。　　 3、各组仔鼠在学习、记忆（神经）行为学方面的结果评价　　 (1)跳台实验　　 在仔鼠跳台实验中，学习反应时间随染铝剂量的增加而延长，高剂量组学习反应时间显著长于对照组(P＜0.01)。学习错误次数随染铝剂量的增加而增加，并有一定的剂量效应关系(P＜0.05);在仔鼠跳台实验中，随着染毒剂量的增加，各剂量组记忆潜伏期有显著缩短的趋势。记忆错误次数随染铝剂量的增加而增加，各组之间有一定的剂量-效应关系(P＜0.01)。　　 (2)穿梭箱实验　　 被动逃避反应指标中，在电击次数方面，高、中剂量组与对照组比较，电击次数显著增多，差异具有显著性(P＜0.01)。在电击时间方面，中、高剂量组显著高于对照组(P＜0.01);在主动逃避时间和主动逃避潜伏时间方面，中、高剂量组与对照组比较，两项指标均显著延长(P＜0.01)，且与低剂量组比较也显著延长(P＜0.01)。　　 (3) Moris水迷宫实验　　 在仔鼠Morris水迷宫实验中，随着染铝剂量的增加，仔鼠寻找平台的时间逐渐延长并有一定的剂量-效应关系(P＜0.01)。与对照组比较，低、中、高剂量组的潜伏期增大，具有显著性差异(P＜0.05);随着染铝剂量的增加，仔鼠的平均速度在实验过程中逐渐降低，运行轨迹呈现越来越复杂的趋势。　　 4、各组仔鼠海马内神经细胞形态学观察　　 HE染色后，各剂量组随着染毒剂量的增加，光镜下神经细胞形态呈现典型的神经细胞受损伤样改变:染色明显减弱，数目减少，细胞层次少而不清，脱失现象明显，细胞空泡变性较明显。　　 5、各组仔鼠海马神经元细胞超微结构观察　　 随着染毒剂量的增加，海马神经元细胞核膜界限模糊，甚至局部有断裂，部分细胞质溶解，无法辨认细胞器。核内常染色质减少，异染色质增加，核内有空泡样改变。核仁不规则、边集。线粒体肿胀，嵴大部分溶解。粗面内质网变短并有中度扩张;随着铝暴露浓度的增加，海马突触活性带变短，突触后致密物较少，突触间隙变窄，突触小泡较少，甚至突触内有空泡现象。　　 二、AlCl3对大鼠海马细胞内钙浓度和CA1区L-LTP的影响　　 （一）不同剂量铝暴露对各组仔鼠海马CA1区L-LTP的影响　　 1、HFS前反应　　 随着染毒剂量的增加，各组仔鼠高频刺激前PS平均幅值略有降低的趋势，但各剂量组间不具有显著性差异(P＞0.05)。　　 2、HFS后反应　　 (1)不同剂量铝暴露对各组仔鼠LTP和LTD发生率的影响　　 HFS后，随着铝暴露剂量的增加，与对照组相比，各铝暴露组L-LTP发生率逐渐降低，甚至部分动物出现了LTD，尤其在高剂量组情况最为严重。而LTD发生率随着铝暴露剂量的增加有逐渐升高的趋势，高剂量组LTD发生率明显高于对照组和低剂量组。对照组L-LTP发生率为85.71％;低剂量组L-LTP发生率为75.00％;中剂量组L-LTP发生率为75.00％，LTD发生率为12.50％;高剂量组L-LTP发生率为66.67％，LTD发生率为22.22％。　　 (2)不同剂量铝暴露对各组仔鼠HFS后PS平均幅值增强率的影响　　 随着染毒剂量的增加，各组仔鼠高频刺激后PS平均幅值增强率明显下降，各剂量组间具有显著性差异，并呈现一定的剂量效应关系(P＜0.01)。与对照组相比，低、中、高剂量组PS平均幅值增强率降低，各组间均具有显著性差异(P＜0.05);与低剂量组相比，中、高剂量组PS平均幅值增强率降低，各组间均具有显著性差异(P＜0.05);与中剂量组相比，高剂量组PS平均幅值增强率降低，但两组间比较没有显著性差异(P＞0.05)。　　 （二）各组仔鼠海马神经元细胞内Ca2+浓度变化　　 随着铝暴露剂量的增加，细胞内Ca2+浓度逐渐降低。低、中、高剂量AlCl3组仔鼠海马细胞内Ca2+浓度明显低于对照组，差异均具有显著性(P＜0.01)。与低剂量组相比，中、高剂量AlCl3组仔鼠海马细胞内Ca2+浓度降低，且有显著性差异，(P＜0.05)。　　 三、AlCl3对大鼠海马cAMP-PKA-CREB信号转导通路的影响　　 1、AlCl3对各组仔鼠海马c-AMP浓度的影响　　 L-LTP后，中、高剂量组仔鼠海马c-AMP浓度与对照组比较均显著降低，差异具有显著性(P＜0.05)，低剂量组比对照组浓度低，但差异不具有显著性(P＞0.05);高剂量组c-AMP浓度显著低于低、中染铝组，差异具有显著性(P＜0.01)。　　 2、AlCl3对各组仔鼠海马PKA蛋白含量的影响　　 L-LTP后，对照组、低、中、高剂量组仔鼠海马PKA蛋白表达水平随着染毒剂量的增加呈现逐渐降低的趋势，存在明显的剂量-效应关系(P＜0.01)。各剂量组与对照组相比，PKA蛋白表达水平均显著降低，差异具有显著性(P＜0.01);中、高剂量组与低剂量组相比，PKA蛋白表达水平均显著降低，差异具有显著性(P＜0.01);高剂量组与低剂量组之间比较，PKA蛋白表达水平显著降低，差异具有显著性(P＜0.01)。　　 3、AlCl3对各组仔鼠海马内p-CREB蛋白含量的影响　　 L-LTP后，子代大鼠海马CA1区、CA3区和皮质区p-CREB的累积积分光密度随着染毒剂量的增加呈现逐渐降低的趋势。在CA1区，中、高剂量组与对照组相比累积积分光密度降低，差异具有显著性(P＜0.05)，高剂量组与低剂量组相比，累积积分光密度降低，差异具有显著性(P＜0.05);在CA3区，中、高剂量组与对照组相比累积积分光密度降低，差异具有显著性(P＜0.05)，高剂量组与低剂量组相比，累积积分光密度降低，差异具有显著性(P＜0.01);在皮质区，低、中、高剂量组与对照组相比，累积积分光密度降低，差异具有显著性(P＜0.01)，中、高剂量组与低剂量组比，累积积分光密度降低，差异具有显著性(P＜0.01)。　　 4、AlCl3对各组仔鼠海马内BDNF mRNA表达的影响　　 L-LTP后，随着染毒剂量的增加，对照组、低、中、高剂量组海马内的BDNFmRNA表达呈现下降趋势，存在明显的剂量-效应关系。各剂量组海马内BDNFmRNA表达与对照组比较均降低，差异具有显著性(P＜0.01);中、高剂量组与低剂量组比较，海马内的BDNF mRNA表达均下降，差异具有显著性(P＜0.05);高剂量组与中剂量组比较，海马内的BDNF mRNA表达下降，差异具有显著性(P＜0.01)。　　 5、AlCl3对各组仔鼠海马内BDNF蛋白含量的影响　　 (1)免疫组化法　　 L-LTP后，子代大鼠海马CA1区、CA3区和皮质区BDNF累积积分光密度随着染毒剂量的增加呈现逐渐降低的趋势。在CA1和CA3区，中、高剂量组与对照组相比累积积分光密度降低，差异具有显著性(P＜0.01)，中、高剂量组与低剂量组相比，累积积分光密度降低，差异具有显著性(P＜0.01)，高剂量组与中剂量组相比，累积积分光密度降低，差异具有显著性(P＜0.05);在皮质区，中、高剂量组与对照组相比累积积分光密度降低，差异具有显著性(P＜0.01)，中、高剂量组与低剂量组相比累积积分光密度降低，差异具有显著性(P＜0.05)。　　 L-LTP后，子代大鼠海马CA1区、CA3区和皮质区BDNF阳性面积比随着染毒剂量的增加呈现逐渐降低的趋势。在CA1和CA3区，中、高剂量组与对照组相比阳性面积比降低，差异具有显著性(P＜0.01)，中、高剂量组与低剂量组相比，阳性面积比降低，差异具有显著性(P＜0.01)，高剂量组与中剂量组相比，阳性面积比降低，差异具有显著性(P＜0.01);在皮质区，低、中、高剂量组与对照组相比阳性面积比降低，差异具有显著性(P＜0.01)，中、高剂量组与低剂量组相比阳性面积比降低，差异具有显著性(P＜0.01)，高剂量组与中剂量组相比，阳性面积比降低，差异具有显著性(P＜0.01)。　　 (2)免疫荧光组化染色法　　 L-LTP后，子代大鼠海马CA1区、CA3区、皮质区和DG区BDNF的平均荧光强度随着染毒剂量的增加呈现逐渐降低的趋势。在CA1区，中、高剂量组与对照组相比平均荧光强度降低，差异具有显著性(P＜0.01)，高剂量组与低剂量组相比，平均荧光强度降低，差异具有显著性(P＜0.01)，高剂量组与中剂量组性比，平均荧光强度降低，差异具有显著性(P＜0.05);在CA3区，中、高剂量组与对照组相比平均荧光强度降低，差异具有显著性(P＜0.01)，中、高剂量组与低剂量组相比平均荧光强度降低，差异具有显著性(P＜0.01)。在皮质区，中、高剂量组与对照组相比平均荧光强度降低，差异具有显著性(P＜0.01)，中、高剂量组与低剂量组相比平均荧光强度降低，差异具有显著性(P＜0.01)。高剂量组与中剂量组比，平均荧光强度降低，差异具有显著性(P＜0.01)。在DG区，低、中、高剂量组与对照组相比平均荧光强度降低，差异具有显著性(P＜0.05)，高剂量组与低剂量组相比，平均荧光强度降低，差异具有显著性(P＜0.01)，高剂量组与中剂量组相比，平均荧光强度降低，差异具有显著性(P＜0.01)。　　 6、AlCl3对各组仔鼠海马内c-Jun蛋白含量的影响　　 L-LTP后，随着染毒剂量的增加，对照、低、中、高剂量组海马内c-Jun蛋白含量呈现下降趋势，存在明显的剂量-效应关系(P＜0.01)。各剂量组海马内c-Jun蛋白含量与对照组比较均降低，差异具有显著性(P＜0.01);中、高剂量组与低剂量组比较，海马内的c-Jun蛋白含量均下降，差异具有显著性(P＜0.01);高剂量组与中剂量组比较，海马内c-Jun蛋白含量略下降，但差异不具有显著性(P＞0.05)。　　 结论：　　 1、出生后亚慢性AlCl3暴露导致仔鼠学习记忆能力低下，海马神经细胞形态异常，海马神经元和神经突触的超微结构受到损害。　　 2、出生后亚慢性AlCl3暴露引起仔鼠海马神经细胞内游离钙浓度降低，损害仔鼠海马CA1区L-LTP诱导和维持，降低L-LTP发生率和PS平均幅值增强率，并导致产生LTD，从而产生损害作用，影响仔鼠的学习记忆功能。　　 3、出生后亚慢性AlCl3暴露降低仔鼠海马c-AMP浓度，减少PKA蛋白含量，降低p-CREB活化水平，造成与学习记忆能力密切相关的cAMP-PKA-CREB信号转导途径受损。同时，也降低了仔鼠海马BDNF mRNA基因表达水平，减少BDNF和c-Jun蛋白含量，削弱cAMP-PKA-CREB信号转导途径下游产物BDNF、c-Jun在学习记忆过程中作用的发挥，从而对大鼠的学习记忆能力产生损害作用。