【摘 要】
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共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）因具有预防“三高”、恶性肿瘤、动脉粥样硬化、抑制脂肪增长等功能而引起科技工作者的关注。CLA是由亚油酸异构酶（linoleic acid isomerase,LAI）催化亚油酸转化而成。微生物催化产生的CLA产物单一、安全系数高且稳定,但是LAI的催化性能还有待加强。本研究以痤疮丙酸杆菌CICC10864（简称为P.acnes）
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共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）因具有预防“三高”、恶性肿瘤、动脉粥样硬化、抑制脂肪增长等功能而引起科技工作者的关注。CLA是由亚油酸异构酶（linoleic acid isomerase,LAI）催化亚油酸转化而成。微生物催化产生的CLA产物单一、安全系数高且稳定,但是LAI的催化性能还有待加强。本研究以痤疮丙酸杆菌CICC10864（简称为P.acnes）的亚油酸异构酶基因为模板,利用易错PCR突变,获得高产CLA突变株。为探究CLA产量与亚油酸异构酶活性之间的关系,采用蛋白组学技术分析突变菌和原菌株的差异蛋白表达谱,找出蛋白质的变化轨迹。运用代谢组学技术分析,寻找差异代谢物,探究关联和变化规律,阐明蛋白质和代谢物差异对P.acnes亚油酸异构酶活性的影响。结果如下:应用定向进化技术,运用多轮的易错PCR,构建了痤疮丙酸杆菌突变菌的突变文库,利用流式细胞仪筛选得到P229突变菌的CLA产量最高为17.4609±0.0007μg/m L,酶活为52.3827 U/m L,与未突变菌的酶活相比提高了4.1454倍。P229突变菌序列完整,同源建模分析发现,共有5个氨基酸突变位点,分别为D101Y、Q138R、F214I、W227R、F256I,突变前后氢键发生了明显的变化,是催化活性提高的直接原因。利用蛋白质组学技术,P229菌株共鉴定出2146个蛋白质,其中2110个可定量;共筛选出104个差异表达蛋白,其中下调蛋白47个,上调蛋白57个。代谢组学技术分析发现多种代谢物,分布在不同的代谢通路,发挥着不可或缺的作用。差异表达蛋白主要分布在淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢和磷酸转移酶系统。通过糖酵解和三羧酸循环途径可知,一共注释了三个差异代谢物,分别是磷酸烯醇丙酮酸、乙酰辅酶A、谷氨酸。五个差异表达蛋白上调,分别是epd、crr、pfk B、tre B、gdh A。与谷氨酸代谢相关的蛋白gdh A、mtr表达上调,有利于促进亚油酸向共轭亚油酸的转变。解析基因工程菌株的CLA合成途径解析发现,上调碳水化合物、氨基酸代谢中的关键蛋白可以提高CLA的产量,为实现CLA的工业化生产奠定一定的理论基础。
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