公羊繁殖性能主要体现在配种能力和精液品质两个方面,精液品质则与睾丸组织结构密切相关。睾丸发育和精子发生是影响公羊繁殖能力的重要因素。小尾寒羊是我国优良的地方绵羊品种,以高繁殖力著名,是肉羊产业发展中广泛使用的母本品种,在我国肉羊产业化发展过程中发挥着重要作用。本研究以小尾寒羊公羊为研究对象:一、对小尾寒羊公羊进行繁殖性能研究挑选出2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸,采用H.E.染色方法进行组织学观察。二、在2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸组织结构和精子发生进程差异的基础上,构建睾丸mRNA文库和sRNA文库,利用RNA-seq测序技术和生物信息学方法对2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸中mRNA和miRNA的表达谱进行分析,并对miRNA与mRNA表达谱进行联合分析,构建miRNA-靶基因调控网络,筛选出睾丸发育和精子发生的关键miRNA及其靶基因。三、利用qRT-PCR方法对测序数据进行验证,并采用双荧光素酶报告基因检测系统对筛选出的睾丸发育和精子发生关键miRNA及其靶基因的靶向调控作用进行验证。旨在为揭示小尾寒羊公羊睾丸发育和精子发生的分子调控机制及影响其优秀繁殖性能的分子标记提供理论依据。本研究获得的主要研究结果如下:1.小尾寒羊公羊繁殖性能研究:结果表明,小尾寒羊公羊具有性早熟特性,公羔在75-88日龄出现性行为,6月龄可达性成熟。小尾寒羊睾丸发育与睾酮分泌水平呈正相关,成年公羊射精量多,精液密度大,精子活率高,精子在体外存活时间长,精液品质好,可用于常年配种。且2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸在曲细精管直径和生精细胞数量等组织学上存在明显差异,可用于后续转录组差异分析。2.不同月龄小尾寒羊睾丸mRNA表达谱分析:成功构建了2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸mRNA文库,2月龄vs 6月龄睾丸获得630个差异基因(470个上调和160个下调),6月龄vs 12月龄睾丸获得322个差异基因(218个上调和104个下调),2月龄vs 12月龄睾丸获得102个差异基因(82个上调和20个下调)。GO和pathway分析表明2月龄vs 6月龄睾丸的差异基因显著富集到雄性求偶,类固醇代谢和精子发生等191个生物过程及氨基糖与核苷酸代谢,核苷酸切除修复及AMPK等17条信号通路。6月龄vs 12月龄睾丸的差异基因显著富集到有性生殖,发育性细胞凋亡及精子获能等311个生物过程及核糖体,多糖降解和核黄素代谢等8条信号通路。3组差异基因取并集后获得的955个差异基因趋势分析,共获得8种表达谱并归类为4种模式表达谱,根据4种模式表达谱构建了4个基因间共表达网络,筛选出29个睾丸发育和精子发生的关键基因。随机选取13个基因(CA3,APOH,MYOC,CATSPER4,SYT6,SERPINA10,DAZL,ADIPOR2,RAB13,CEP41,SPAG4,ODF1和FRG1)对mRNA测序数据进行qRT-PCR验证,qRT-PCR结果与RNA-seq结果趋于一致,证明了mRNA测序数据的准确性。3.不同月龄小尾寒羊睾丸miRNA表达谱分析:成功构建了2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸miRNA文库,2月龄vs 6月龄,6月龄vs 12月龄和2月龄vs12月龄睾丸中分别鉴定出差异表达绵羊已知miRNA:5个,1个和4个;差异表达novel miRNA:132个,105个和24个。选取6个差异表达绵羊已知miRNA(oar-miR-379-5p,oar-miR-665-3p,oar-miR-200b,oar-miR-409-3p,oar-miR-495-3p和oar-miR-200c)和6个差异表达novel miRNA(has-miR-3592-5p,has-miR-6820-3p,has-miR-3615,mmu-miR-1957b,mmu-miR-182-3p和mmu-miR-1929-3p)对miRNA测序数据进行qRT-PCR验证,qRT-PCR结果与RNA-seq测序结果趋于一致,证明了miRNA测序数据的准确性。4.差异表达miRNA靶基因预测:结合miRNA与mRNA结果,对2月龄vs 6月龄,6月龄vs 12月龄和2月龄vs 12月龄睾丸差异表达miRNA进行靶基因预测,差异表达绵羊已知miRNA分别得到68个,1个和9个靶基因,差异表达novel miRNA分别得到363个,168个和29个靶基因。靶基因的GO和pathway分析表明,2月龄vs 6月龄睾丸差异表达绵羊已知miRNA的靶基因显著富集到细胞凋亡,减数分裂I期,顶体反应等100个生物过程及Hedgehog和Wnt等11条信号通路;6月龄vs 12月龄睾丸差异表达绵羊已知miRNA的靶基因显著富集到多细胞生物生殖,精卵结合,单受精和蛋白水解4个生物过程;2月龄vs 12月龄睾丸差异表达绵羊已知miRNA的靶基因显著富集到腺苷代谢,嘌呤碱基代谢及核苷酸代谢等17个生物过程及核黄素代谢和花生四烯酸代谢等4条信号通路。5.睾丸发育和精子发生关键miRNA及其靶基因筛选验证:构建了3个miRNA-靶基因调控网络,基于GO和KEGG分析,筛选出睾丸发育和精子发生关键oarmiR-379-5p及其候选靶基因WNT8A和oar-miR-665-3p及其候选靶基因CCIN。双荧光素酶报告基因检测系统结果证明了WNT8A是oar-miR-379-5p的靶基因,CCIN可能不是oar-miR-665-3p的靶基因。