论文部分内容阅读
研究目的:Coronin蛋白家族是在提纯细胞骨架蛋白时被发现,而Coronin 1a正是Coronin蛋白家族中研究最为广泛的一种。在细胞内,许多涉及到肌动蛋白的细胞骨架运动中Coronin 1a都作为一种辅助因子而存在。Coronin 1a还被发现与寄生虫-宿主反应,神经系统发展及信号传导等过程有关。而Coronin 1a在肿瘤发生发展中的作用一直未被阐明。前期研究发现在不同乳腺癌细胞系中Coronin1a的表达有很大差异,提示Coronin 1a可能与不同分型乳腺癌的肿瘤特性相关。本研究主要探讨Coronin 1a表达量与乳腺癌细胞增殖转移能力的关系,并分析其发挥作用的可能途径。初步阐明Coronin 1a在细胞周期、EMT过程中可能发挥的作用。研究内容:分析Coronin 1a在不同乳腺癌细胞系内的表达情况,筛选Coronin 1a低表达的细胞系;构建Coronin 1a高表达载体;建立Coronin 1a高表达的乳腺癌细胞系;通过体内和体外实验研究Coronin 1a表达对乳腺癌细胞增殖和转移能力的影响并初步探讨其潜在的分子机制。研究方法:本研究首先检测了常见乳腺癌细胞系T47D、MDA-MB-231、MCF10A、MCF-7、SK-Br-3、293中Coronin 1a的表达情况,筛选出Coronin 1a低表达的细胞系。进而通过逆转录、PCR等技术扩增目的基因Coronin 1a,并通过与真核表达载体连接,构建出Coronin 1a的真核表达载体。利用慢病毒感染向Coronin1a低表达的细胞系内介导Coronin 1a过表达质粒,即成功构建Coronin 1a的高表达乳腺癌细胞株。应用MTT,平板克隆,EDU,流式细胞术等方法探究Coronin1a与乳腺癌细胞增殖之间的关系;应用Transwell,划痕实验,EMT相关指标的Western Blot实验探究Coronin 1a与乳腺癌细胞运动转移能力之间的关系。最后通过向裸鼠皮下注射过表达Coronin 1a的细胞悬液,探究Coronin 1a对活体动物成瘤能力的影响。通过我们的研究,第一次探讨了Coronin 1a在乳腺癌增殖转移能力中所发挥的作用,并初步探讨了其可能参与的调控途径。研究结果:我们发现,Coronin 1a在MDA-MB-231细胞系和SK-Br-3细胞系中低表达,在MCF-7细胞系、MCF-10A细胞系中高表达,在T47D、293细胞系中则为阴性表达。通过构建pc DNA3.0-HA-Coronin 1a质粒并向MDA-MB-231,SK-Br-3细胞内介导转染,我们成功构建出Coronin 1a的高表达细胞株。MTT,平板克隆,EDU实验均证实Coronin 1a的过表达明显促进了乳腺癌细胞的增殖。应用流式细胞术对细胞周期进行检测发现,过表达Coronin 1a后,乳腺癌细胞中处于S期的比例明显升高。提示Coronin 1a可能通过调控细胞周期影响乳腺癌细胞的增殖活性。Transwell,划痕实验均证实Coronin 1a的过表达明显增强了乳腺癌细胞的运动转移能力。EMT相关指标的Western blot实验表明,过表达Coronin 1a是E-cadherin表达下降,N-cadherin表达升高,Vimentin与Snail表达也相应升高,提示Coronin 1a对乳腺癌细胞运动转移能力的影响可能与其促进了EMT转化过程有关。裸鼠成瘤实验证实,过表达Coronin 1a后乳腺癌细胞具有更高的成瘤能力,且Ki-67指标明显高于对照组。研究结论:Coronin 1a与乳腺癌的增殖转移能力密切相关,其可能通过影响细胞周期调控乳腺癌细胞的增殖,可能通过促进EMT过程调控乳腺癌细胞运动转移能力。