农杆菌介导的双价抗虫基因Pta-CrylAc番茄的遗传转化研究

来源 :吉林农业大学 | 被引量 : 6次 | 上传用户:Lu153
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本研究优化了番茄的再生体系和农杆菌介导的番茄转化体系,并构建了应用于农杆菌介导法转化的双价抗虫载体pCAMBIA3300-bt-pta,以番茄品系Micro-Tom为材料进行了番茄转化、转化番茄的分子生物学鉴定以及遗传学分析,并初步进行了转基因番茄的抗虫鉴定工作,主要结果如下: 1 优化了农杆菌介导番茄转化的几个影响因素:①外植体长度在5mm左右有利于愈伤组织的形成;②光照培养比暗培养更有利于愈伤组织的形成;③农杆菌侵染时间为8-10分钟;④菌液浓度OD600约为0.15;⑤侵染液pH=5.2;⑥乙酰丁香酮使用浓度为50μmol/L;⑦共培养时间为三天时获得了最高的转化效率;⑧选用羧苄青霉素为抑菌剂,浓度为300mg/l;⑨以PPT作为选择剂时的浓度为4mg/l。 2 以pCAMBIA3300为骨架,在此基础上构建了含半夏凝集素和苏云金芽孢杆菌的双价抗虫载体,并以根癌农杆菌LBA1100为侵染菌转化番茄。并且,转化后从325个外植体获得再生植株24株,再生率为8.5%。 3 对转化的24株再生植株中进行了PCR检测、RT-PCR检测以及Southern blot检测,并且确定阳性植株为15株,转化率为62.5%。 4 对T1植株进行了抗虫基因CrylAc分离分析,结果符合孟德尔规律,阳性和阴性之比为3∶1;并且抗虫基因CrylAc和抗虫基因Pta共分离。 5 对T1植株进行了除草剂抗性检测,抗除草剂有效成分PPT在20mg/l。 6 对T1代植株BP-1~BP-7进行了小菜蛾幼虫初步抗性鉴定,抗虫性程度较为显著,但不同植株差异较大。
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