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目的:通过研究急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia,AML)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)和慢性髓细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)等髓系肿瘤骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)的生物学和遗传学特性的改变,探讨髓系肿瘤骨髓微环境(bone marrow microenvironment,BMM)的变化。方法:(1)MSC的分离和鉴定:首先采用Ficoll淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞(mononuclear cells,MNC),然后采用贴壁法去除悬浮细胞,留下贴壁细胞。采用流式细胞术、诱导分化实验和集落形成实验对分离的MSC进行鉴定;(2)MSC生物学特性分析:CCK8法、集落形成实验检测MSC的增殖能力,衰老β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色法检测MSC的衰老细胞比例,长期共培养起始细胞(long-term culture-initiating cell,LTC-IC)实验检测MSC的造血支持能力;(3)MSC遗传学分析:应用常规核型分析(conventional cytogenetic analysis,CCA)和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术检测骨髓造血细胞(hematopoietic cells,HC)和MSC的细胞遗传学,MDS患者骨髓FISH检测采用MDS组套探针,CML患者采用bcr-abl双色双融合探针;NGS技术检测AML患者与MDS患者骨髓HC和MSC的热点基因突变。结果:1.MSC的分离与鉴定:取第3代分离的贴壁细胞进行鉴定。(1)经流式细胞术检测,该贴壁细胞不表达HC的标志抗原,如CD45和CD34;表达CD44、CD73、CD90和CD105。(2)诱导分化实验表明贴壁细胞可向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化,说明该贴壁细胞具有多向分化的潜能。(3)集落形成实验表明,单个贴壁细胞能够增殖形成经染色后肉眼可见的克隆单位,说明该贴壁细胞具有自我更新的干细胞特性。上述鉴定结果均符合国际治疗学会(international Society for Cellular Therapy,ISCT)制定的鉴定MSC的最低标准,因此可以认为所分离纯化的贴壁细胞为MSC。2.MSC的生物学特性:髓系肿瘤组(AML、MDS或CML患者)与健康供者(healthy donor,HD)对照组骨髓MSC在增殖能力、衰老细胞比例以及造血支持能力等三方面存在的差异。CCK8法检测结果显示:从第3-4d开始,髓系肿瘤组的增殖速度显著低于对照组;但髓系肿瘤组内无明显差异。同样,集落形成实验也表明,较HD组,髓系肿瘤组的增殖能力显著降低,但各肿瘤组内无明显差异。HD、AML、MDS和CML的集落形成个数分别为:13.55±2.73、9.73±2.53、7.75±1.91与7.60±3.06。SA-β-Gal染色实验结果为:第8代AML、MDS和CML骨髓MSC的衰老细胞占比分别为56.38±6.23%、53.75±14.66%和60.17±6.52%,显著高于HD组的衰老细胞占比(23.14±4.18%)。可见,髓系肿瘤骨髓MSC较HD-MSC更容易衰老。将骨髓MSC与HD骨髓CD34~+HSC长期共培养,通过计数起始细胞数来评估MSC的造血支持能力。相比于对照组,与髓系肿瘤组MSC长期共培养后的HD骨髓CD34~+HSC所形成的集落个数明显减少。髓系肿瘤组的起始细胞数(CFU-GM、CFU-E和BFU-E集落个数总和)约为HD组的1/3,说明髓系肿瘤组MSC造血支持能力受损,但组内无明显差异。3.MSC的遗传学特征:分析AML、MDS和CML患者骨髓MSC和HC的细胞遗传学及热点基因的突变情况以探究髓系肿瘤MSC与HC遗传学特性及其关系。行CCA检测29例AML患者骨髓HC和MSC的细胞核型,其中骨髓HC检出异常核型的患者有16例,但在骨髓MSC中均未检出细胞遗传学异常。联合CCA和FISH检测37例MDS患者和15例CML患者骨髓MSC与HC的特异性位点的染色体异常。34例MDS患者骨髓HC培养成功、有分裂相,其中16例检出核型异常;但骨髓MSC的细胞核型均未检出异常;10例MDS患者骨髓HC经FISH检出5q-、7q-和+8等位点的改变,但其骨髓MSC的检测结果也均为阴性。CML患者骨髓HC均检出费城染色体和bcr-abl融合基因,但骨髓MSC均未检出。采用二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术进一步检测AML和MDS骨髓HC和MSC热点基因,发现送检标本的HC均检出若干个基因突变,但是,仅有1例AML患者的MSC样本检出AXSL1基因突变。结论:密度梯度离心法联合贴壁法分离MSC方法可靠,所提取的MSC具有干细胞特性,符合ISCT制定的定义MSC的最小鉴定标准。髓系肿瘤患者骨髓MSC生物学功能受损,表现为MSC增殖能力、自我更新能力和造血支持功能均减弱,具有明显衰老倾向。遗传学特征在髓系肿瘤患者骨髓MSC与骨髓HC之间无相关性。