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背景和目的恶性肿瘤已成为全球范围内威胁人类健康和生存的一大杀手,其发病率和死亡率逐年上升。传统的手术、放疗和化疗等历经百年发展,依然无法有效控制肿瘤的进展和复发。近年来,T细胞在抗肿瘤过程中的重要作用被揭示,然而肿瘤患者体内T细胞的功能和活性被抑制,这被认为是导致肿瘤发生和进展的关键诱因。因此,以增强T细胞功能为目的的嵌合抗原受体T（Chimeric antigen receptor T,CAR-T）细胞和免疫检查点阻断抗体（Immune checkpoint blockade,ICB）等新兴免疫治疗手段被开发出来,并展示出了强大的抗肿瘤潜力。然而免疫治疗虽然在血液系统肿瘤中展示了良好的临床疗效,其在实体瘤中的效果却微乎其微。研究显示,实体瘤微环境中的免疫抑制细胞是制约T细胞功能的主要原因。肿瘤微环境是由T细胞、B细胞、NK细胞、髓系细胞、肿瘤细胞及其他组分组成的复杂环境,其中骨髓来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressive cells,MDSCs）的浸润会通过抑制效应T细胞的激活进而导致免疫治疗的不稳定性,并通过多种方式抑制CD8+T细胞的增殖和功能而显著抑制免疫治疗的效率。探索MDSCs抑制T细胞的主要原因和机制,对于增强肿瘤免疫治疗效果具有非常重要的临床意义。本课题组前期研究结果表明,GPR84主要表达在MDSCs上,并且能促进MDSCs的扩增及其免疫抑制功能。基于之前的研究基础,本课题将进一步利用临床标本、细胞模型和动物模型等深入探讨GPR84参与MDSCs对CD8+T细胞功能抑制的潜在机制。方法1.构建OT-1 CD8+T cells与GPR84+MDSCs或GPR84-MDSCs的共培养体系,检测MDSCs对CD8+T细胞特异性杀伤能力及相关功能因子释放的影响。2.将GPR84+MDSCs和GPR84-MDSCs与CD8+T细胞直接、间接共培养以及用MDSCs培养上清液培养CD8+T细胞,采用流式细胞术检测CD8+T细胞上GPR84表达情况。3.提取MDSCs培养上清中的外泌体,通过使用电镜、NTA、western-blot技术鉴定外泌体。进一步使用免疫荧光等技术验证CD8+T细胞摄取外泌体的能力,证明MDSCs通过分泌外泌体将GPR84转移至CD8+T细胞上。4.通过在CD8+T细胞上过表达和敲除GPR84,两个角度验证GPR84对CD8+T细胞增殖、抗肿瘤功能相关分子表达、分泌及基因水平的影响。5.构建OT-1 GPR84-/-小鼠,将其CD8+T细胞体外活化并荧光标记后过继回输到B16-OVA荷瘤小鼠体内,进一步证明GPR84在体内能影响CD8+T细胞的抗肿瘤功能。6.将使用GPR84+MDSCs或GPR84-MDSCs培养上清液培养后的CD8+T细胞进行转录组测序,根据差异基因进行KEGG和GSEA通路富集分析,寻找GPR84影响CD8+T细胞功能和生存的信号通路及机制。7.利用TCGA数据库分析GPR84对高表达CD8患者预后的影响。检测肿瘤患者及健康人外周血中GPR84在CD8+T细胞上的表达差异,并分析MDSCs上GPR84的表达与CD8+T细胞比例及其GPR84表达的相关性,揭示GPR84在CD8+T细胞上表达的临床意义。结果1.与GPR84+MDSCs共培养后,CD8+T细胞的特异性肿瘤杀伤能力、增殖及抗肿瘤相关分子的表达明显受到抑制。2.在共培养条件下,GPR84+MDSCs组CD8+T细胞的GPR84表达升高,进一步将GPR84-/-CD8+T细胞与GPR84+MDSCs共培养发现,MDSCs可能通过转移GPR84至CD8+T细胞的方式影响其功能。3.MDSCs能通过分泌外泌体将其自身GPR84转移到CD8+T细胞上。4.在CD8+T细胞上分别过表达和敲除GPR84,发现GPR84能抑制CD8+T细胞的增殖和抗肿瘤相关功能因子的表达和分泌。5.体内实验进一步证明GPR84影响CD8+T细胞的抗肿瘤能力及其淋巴归巢和在肿瘤组织的浸润。6.GPR84促进CD8+T细胞产生ROS使其DNA损伤,激活p53信号通路促进CD8+T细胞进入衰老状态进而影响其功能。7.GPR84在肿瘤患者外周血CD8+T细胞上表达升高,其表达与肿瘤患者的不良预后相关。MDSCs上GPR84的表达与CD8+T细胞比例负相关而与CD8+T细胞上GPR84的表达呈正相关。且GPR84的表达与患者对于化疗的耐受有关。结论MDSCs可以通过分泌外泌体将GPR84转移至CD8+T细胞上,通过促进CD8+T细胞产生ROS使其DNA损伤,从而激活p53信号通路使CD8+T细胞进入衰老状态进而抑制其增殖和抗肿瘤功能,以此来增强MDSCs对于CD8+T细胞的免疫抑制功能。