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在哺乳动物中,雄性的繁殖效率远高于雌性,因而对雄性动物进行选择的强度大,育种效果好。理论上,用孤雄生殖技术构建的胚胎拥有两套父源遗传物质,如果胚胎能完成整个发育过程、直至出生,则可通过引进冻精来实现最优种公畜个体的引种和扩繁,实现新品种的培育。然而,由于孤雄胚胎只含有单亲基因组,所以胚胎存活力极低,是否存在某些等位印记基因的亲缘特异性表达和异常的表观遗传修饰问题,尚无定论。本研究比较了牛孤雄胚、孤雌胚和体外受精胚在体外培养条件下的发育率、组蛋白H3和H4乙酰化水平的变化规律、发育相关基因的表达情况,进一步利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理牛孤雄胚,观察其对胚胎发育率的影响、分析处理后胚胎中组蛋白H3和H4乙酰化水平和囊胚质量的变化情况,以探讨牛孤雄胚早期发育过程中的表观遗传调控机制,为开发提高牛孤雄胚早期发育率的新方法奠定基础。主要研究结果如下：1.牛孤雄胚早期发育能力及其与孤雌胚和体外受精胚的比较比较牛孤雄胚、孤雌胚和体外受精胚在相同培养体系下发育至2-细胞、4-细胞、8-16-细胞、桑葚胚和囊胚阶段的比率,发现：在2-细胞到囊胚胚阶段,孤雄胚的发育能力显著低于体外受精胚和孤雌胚,特别是囊胚发育率,孤雄胚只有7.79±0.97%,显著低于体外受精胚(36.37±1.17%)和孤雌胚(42.32±0.68%)(p<0.05),说明牛孤雄胚的早期体外发育能力显著低于体外受精胚和孤雌胚。2.牛孤雄胚早期发育过程中组蛋白H3和H4乙酰化水平的变化规律及其与孤雌胚和体外受精胚的比较应用细胞免疫荧光染色的方法,比较牛孤雄胚、孤雌胚和体外受精胚在相同培养体系下发育至2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞、桑葚胚和囊胚中的组蛋白H3和H4整体乙酰化水平及其变化规律,发现：(1)牛孤雄胚、孤雌胚和体外受精胚早期发育过程中组蛋白H3乙酰化水平的变化：在2-细胞和4-细胞阶段,牛孤雄胚、体外受精胚和孤雌胚中组蛋白H3的乙酰化水平高低相互比较均无显著差异；在8-细胞阶段孤雄胚中组蛋白H3的乙酰化水平与体外受精胚或孤雌胚相比差异不显著,不过此阶段孤雌胚中的组蛋白H3乙酰化水平显著高于体外受精胚(p<0.05)；在16-细胞阶段孤雄胚中组蛋白H3的乙酰化水平显著低于体外受精胚(p<0.05),但孤雄胚中组蛋白H3的乙酰化水平与孤雌胚相比差异不显著；在桑葚胚和囊胚阶段的孤雄胚中组蛋白H3的乙酰化水平均显著低于体外受精胚和孤雌胚(p<0.05),孤雌胚与体外受精胚中的组蛋白H3的乙酰化水平差异均不显著。在整个早期胚胎体外发育过程中,孤雄胚、孤雌胚和体外受精胚中组蛋白H3的乙酰化水平变化规律均呈先下降后上升的趋势,孤雄胚和孤雌胚组蛋白H3的乙酰化水平均在16-细胞阶段左右达到最低水平,而体外受精胚组蛋白H3的乙酰化水平在8-细胞阶段左右达到最低水平。(2)牛孤雄胚、孤雌胚和体外受精胚早期发育过程中组蛋白H4乙酰化水平的变化：在2-细胞和4-细胞阶段,牛孤雄胚、体外受精胚和孤雌胚中组蛋白H4的乙酰化水平高低相互比较也均无显著差异；在8-细胞阶段孤雄胚中组蛋白H4的乙酰化水平显著低于体外受精胚和孤雌胚(p<0.05),但此阶段的孤雌胚和体外受精胚中组蛋白H4乙酰化水平差异不显著；在16-细胞、桑葚胚和囊胚阶段孤雄胚中组蛋白H4的乙酰化水平显著低于体外受精胚(p<0.05),不过孤雄胚中组蛋白H4的乙酰化水平与孤雌胚相比差异不显著,孤雌胚与体外受精胚相比差异也不显著。在整个早期胚胎体外发育过程中,孤雄胚、孤雌胚和体外受精胚中组蛋白H4的乙酰化水平变化规律也都呈先下降后上升的趋势,孤雄胚组蛋白H4的乙酰化水平在8-细胞阶段左右达到最低水平,而孤雌胚和体外受精胚组蛋白H4的乙酰化水平均在4-细胞阶段左右达到最低水平。以上研究结果表明,牛孤雄胚、孤雌胚和体外受精胚早期发育过程中组蛋白H3和H4乙酰化水平呈动态变化且在3种胚胎之间存在差异；孤雄胚在早期胚胎发育过程中整体乙酰化水平偏低,这可能是导致其发育效率低下的因素之一。3.牛孤雄生殖囊胚中发育相关基因的表达及其与孤雌胚和体外受精胚的比较应用荧光定量PCR方法检测牛孤雄胚、孤雌胚和体外受精胚囊胚中发育潜能基因(OCT4和CDX2)、印记基因(父系印记母源表达基因：H19和IGF2R:母系印记父源表达基因：IGF2和SNRPN)和组蛋白去乙酰化调控基因(HDAcl和HDAC2)的mRNA表达水平的差异,发现：(1)发育潜能基因的表达：孤雄胚中OCT4基因的mRNA表达水平显著低于体外受精胚和孤雌胚(p<0.05),孤雌胚和体外受精胚中OCT4基因的mRNA表达水平差异不显著；孤雄胚和体外受精胚中CDX2基因的mRNA表达水平差异不显著,但孤雄胚中CDX2基因的mRNA表达水平显著高于孤雌胚(p<0.05)(2)印记基因的表达：孤雄胚中父系印记母源表达基因H19和IGF2R的mRNA表达水平均显著低于体外受精胚(p<0.05),相反,孤雌胚中H19和IGF2R基因的mRNA表达水平显著高于体外受精胚(p<0.05)；孤雄胚的母系印记父源表达基因IGF2的mRNA表达水平显著高于体外受精胚(p<0.05),不过孤雄胚中另一种母系印记父源表达基因SNRPN的mRNA表达水平却显著低于体外受精胚(p<0.05),孤雌胚中IGF2和SNRPN的mRNA表达水平均显著低于体外受精胚(p<0.05)。(3)组蛋白去乙酰化调控基因的表达：牛孤雄胚中组蛋白去乙酰化调控基因HDAC1和HDAC2的mRNA表达水平均显著高于体外受精胚的表达量(p<0.05),但孤雄胚和孤雌胚中两基因的表达水平差异不显著。以上研究结果表明,牛孤雄胚、孤雌胚和体外受精胚囊胚中调控胚胎发育的基因存在表达差异,发育潜能基因、印记基因和组蛋白去乙酰化酶调控基因的异常表达可能与牛孤雄胚早期胚胎发育能力低下有关。4组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理对牛孤雄胚发育效率的影响以牛孤雄胚早期发育可能存在异常的表观修饰为起点,应用调控早期胚胎发育的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA和SCR)处理所构建的牛孤雄胚,检测牛孤雄胚不同时期的发育率,分析其与去乙酰化酶抑制剂浓度、处理时间以及处理方式的关系,研究结果如下：(1)抑制剂处理浓度影响胚胎发育率：分别利用6个浓度的TSA(0、5、10、20、50和100nM/L)或SCR(0、50、100、200、300和500nM/L)在孤雄胚激活后的培养阶段处理15h,发现较低浓度的TSA (5-20nM/L)或SCR(50-200nM/L)能够显著改善孤雄胚发育到8-16细胞、桑椹胚和囊胚的比率(p<0.05)；高浓度的TSA (100nM)或SCR (500nM)处理孤雄胚不利于其发育,甚至从2细胞阶段开始已经影响到胚胎的发育效率,降低了处理后胚胎的存活率,而且使胚胎发生胞质碎裂的比率显著上升(p<0.05)。这表明,组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理孤雄胚后胚胎的发育能力与抑制剂的处理浓度密切相关,20nM TSA或200nM SCR是有益于孤雄胚发育的最适浓度。(2)抑制剂处理时间长短影响胚胎发育：发现用20nM TSA在孤雄胚激活后的培养阶段分别处理0、10、15、20和25h后,其囊胚发育比率分别为10.45±0.82%,12.59±1.16%,18.29±1.03%,16.83±0.85%和8.35±1.35%；200nMSCR处理孤雄胚0,10,15,20和25h后,其囊胚发育比率分别为10.45±0.82%,11.29±0.77%,19.84±1.05%,17.37±1.31%和14.07±1.28%。这说明,孤雄胚的发育能力与组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理的时间长短密切相关,处理时间过短或偏长都不利于孤雄胚发育,两种抑制剂处理的最适时间长度均在15-20h。(3)抑制剂处理方式影响胚胎发育率：用三种方式处理孤雄胚,发现：方案1(在胚胎构建后修整期用20nM TSA(或200nM SCR)处理2h+胚胎激活阶段4h+培养阶段9h)和方案2(胚胎激活期抑制剂处理4h+培养阶段11h)处理胚胎后,胚胎发育至桑椹胚和囊胚阶段的比率均低于方案3(胚胎激活后培养阶段抑制剂处理15h)。所有用20nM TSA或200nM SCR处理的方案中,胚胎发育至桑椹胚和囊胚的比率均高于未处理的对照组。这表明,在培养阶段开始用蛋白去乙酰化酶抑制剂处理胚胎发育效果较好。5组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理对牛孤雄生殖囊胚中组蛋白H3和H4乙酰化水平以及囊胚质量的影响(1)应用细胞免疫荧光染色的方法比较用组蛋白去乙酰化酶抑制剂(20nMTSA或200nMSCR)处理牛孤雄胚后,发育至囊胚阶段胚胎的组蛋白H3和H4整体乙酰化水平的改变情况。结果表明,200nM SCR处理孤雄胚后囊胚中的组蛋白H3的整体乙酰化水平显著高于未处理的对照组孤雄胚(p<0.05),20nMTSA处理组囊胚的H3的整体乙酰化水平也高于对照组；20nMTSA或200nMSCR处理孤雄胚后囊胚中的组蛋白H4的整体乙酰化水平均显著高于未处理的对照组孤雄胚(p<0.05)。这说明,组蛋白去乙酰化酶抑制剂在培养阶段处理牛孤雄胚可以提高囊胚阶段胚胎的组蛋白H3和H4的整体乙酰化水平。(2)应用囊胚区分染色的方法比较分析组蛋白去乙酰化酶抑制剂(20nMTSA或200nM SCR)处理牛孤雄胚后,发育至囊胚阶段胚胎的质量。结果发现,在胚胎激活后培养阶段用200nM SCR对孤雄胚处理15h左右,发育至第8天的囊胚总细胞数、ICM细胞数、TE细胞数和ICM/TE比率均显著高于未处理的对照组胚胎(p<0.05)；而用另一种抑制剂,20nM TSA处理孤雄胚后,其囊胚质量也得到改善。这表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理孤雄胚能改善其囊胚质量,SCR的处理效果要优于TSA。本研究的主要结论：在相同体外培养体系下,牛孤雄胚的发育能力显著低于体外受精胚和孤雌胚；组蛋白H3和H4整体乙酰化水平在这三种胚胎的早期发育过程中存在差异,且呈动态变化,孤雄胚在早期胚胎发育过程中组蛋白整体乙酰化水平与体外受精胚和孤雌胚相比较低,这可能是导致其早期体外发育能力低下的因素之一；此外,影响和调控牛早期胚胎发育的基因在牛孤雄、孤雌和体外受精囊胚中的mRNA表达水平存在差异,发育潜能基因表达缺陷、印记基因和组蛋白去乙酰化酶调控基因的表达异常可能与牛孤雄胚发育缺陷有关。利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂对孤雄胚处理,能促进胚胎发育,特别是发育到桑葚胚和囊胚的能力,20nM TSA或200nM SCR是处理孤雄胚的最适浓度,处理较适宜的时间是在胚胎激活后的培养阶段,处理适宜时间长度为15h左右；利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA或SCR处理后得到的囊胚中组蛋白H3和H4整体乙酰化水平升高,其囊胚质量也得到改善,这说明组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理胚胎可以作为体外快速高效构建孤雄胚的有效手段之一。