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研究背景:心肌纤维化是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变,可引起心肌顺应性降低、心律失常等改变,最终导致心力衰竭。蛋白质巯基亚硝基化修饰(S-nitrosylation)作为一种全新的氧化还原信号转导调节机制,参与到多种组织器官功能中。热休克蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)作为一种分子伴侣蛋白,在细胞保护、细胞骨架形成、抗凋亡和信号转导方面起着重要的作用。已有报道称Hsp90可发生巯基亚硝基化修饰,然而Hsp90巯基亚硝基化修饰在心血管系统中尤其是心肌纤维化中是否发挥重要的调控作用,目前尚不清楚。因此,Hsp90巯基亚硝基化修饰对心肌纤维化的影响及其确切作用机制需进行深入的探讨和研究。研究目的:本研究主要在离体细胞及整体动物水平上探讨Hsp90蛋白质颈基亚硝基化修饰对心肌纤维化的影响,并阐明其发挥作用的具体机制。研究方法和结果:取健康12周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)及其对照组(WKY)的心肌组织,以及8-10周龄雄性C57BL/6J小鼠行主动脉缩窄术(TAC)及sham组的心肌纤维化模型的心肌组织,用biotin-switch的方法特异性检测蛋白质巯基亚硝基化修饰水平,结果表明:Hsp90的巯基亚硝基化修饰水平在不同纤维化模型中均增加。分离并培养新生乳大鼠原代心脏成纤维细胞,给予100 nM 血管紧张素 Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)处理 24 h,用 biotin-switch 的方法提取成纤维细胞巯基亚硝基化修饰蛋白,结果表明:在细胞纤维化模型中,Hsp90巯基亚硝基化修饰水平明显增加。上述结果提示:Hsp90巯基亚硝基化修饰可能参与心肌纤维化的过程。此外,利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术筛选Hsp90发生巯基亚硝基化修饰的位点,结果发现,Hsp90蛋白质半胱氨酸587和588位点可发生巯基亚硝基化修饰。在此基础上,通过构建半胱氨酸特异性位点突变质粒,将Hsp90半胱氨酸C587、C588位点突变成丙氨酸(C587A、C588A、C587&588A)并构建腺病毒,感染新生乳大鼠原代成纤维细胞,给予Ang Ⅱ刺激,real time PCR法检测Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA水平,以及a-SMA荧光染色观察心肌纤维化程度。结果显示:将半胱氨酸587位点突变后,AngⅡ刺激引起的心肌纤维化程度得到明显改善。而半胱氨酸588位点突变对心肌纤维化程度没有明显影响。同时,我们用半胱氨酸587位点突变的腺病毒(Ad C587A)及野生型腺病毒(Ad WT)感染原代成纤维细胞,检测Hsp90与TGF-β1Ⅱ型受体(TβRⅡ)的结合能力,结果表明587位点突变后,Hsp90与TβRⅡ的结合能力减弱,进而改善纤维化水平。结论:综上所述,在促纤维化条件刺激下,Hsp90的587位半胱氨酸发生巯基亚硝基化修饰可以促进Hsp90与TGF-β1 Ⅱ型受体的结合,进而促进心肌纤维化的发生发展。