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冠心病是世界范围内严重危害人类健康的常见病和多发病。心肌缺血、缺氧是冠心病的重要病理改变,及时恢复血流再灌虽然能够挽救心梗患者的生命,但随之引起的心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)损伤极易导致心肌顿抑、心律失常甚至猝死等事件发生,严重影响心梗患者的预后。目前,研究认为心肌I/R损伤的发病机制主要包括能量代谢障碍、自由基损伤、钙超载和细胞凋亡等,而线粒体不仅是高耗能心肌细胞ATP的主要来源,更具有参与调控细胞内钙稳态、ROS产生、细胞的凋亡和自噬及细胞信号转导等重要的生物学功能。因此,近年来线粒体在心肌I/R过程中扮演的角色已经受到广泛关注,而保护线粒体的结构和功能,增强其缺血耐受性成为防治I/R损伤的重要策略。中医学认为,心血瘀阻致使心脉失养,不通则痛,从而引起“胸痹”、“心痛”,其特点与现代冠心病心绞痛基本相符。心气虚是胸痹心痛发病的主要机制之一,其中气虚为本,血瘀为标,发病过程中多虚实相间,互相兼杂。因此,“胸痹”、“心痛”的重要治则常不离益气活血,祛瘀止痛。复方双参宁心(SSNX)是本院研发的治疗气虚血瘀证冠心病心绞痛的组分中药,由人参、丹参和延胡索中的活性成分群组成,即人参总皂苷、丹参总酚酸和延胡索总生物碱成分按原方比例配伍而成。其中,人参益气补虚,丹参活血化瘀,延胡索辛散温通、行气止痛,三药配伍,标本兼治,以达益气活血,理气止痛之功效。SSNX组分特色明显,疗效确切,极具应用前景,值得深入研究开发。前期药理研究表明,SSNX对缺血心肌有较好的保护作用,可有效改善缺血心脏的血流动力学参数,并促进心功能的恢复。由于心梗后心功能的恢复与具有完整舒缩功能的心肌细胞的数量以及细胞的能量代谢状态密切相关,且初步研究发现SSNX可能通过改善心肌细胞能量代谢和降低细胞不可逆损伤达到抗心肌缺血性损伤的作用,因此,深入系统的阐明SSNX的这一保护作用及机理,将为其临床应用提供有力依据和参考。正常情况下,心肌所需ATP约97%来源于线粒体氧化磷酸化,以维持心肌细胞的舒缩功能和离子泵功能,而I/R引起的线粒体结构及功能的改变将直接导致心肌细胞的能量代谢障碍；此外,心肌I/R可导致线粒体呼吸链酶活性降低,线粒体膜电位(△Ψm)降低,促凋亡蛋白释放启动细胞凋亡等。最近的研究发现,横跨线粒体内膜和外膜的线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)对I/R过程中心肌细胞的死亡起到关键的调控作用。特别是在再灌注初期, ROS的爆发性生成,Ca2+的迅速聚集以及pH的逐渐恢复均为mPTP的开放提供了有利条件,而mPTP的开放将直接导致线粒体内膜通透性转换,线粒体肿胀甚至破裂,最终导致细胞死亡。目前,通过直接干预mPTP组成成分或间接减少mPTP开启诱因来抑制mPTP的开启被认为是防治心肌I/R损伤的重要策略。基于此,本研究将采用在体大鼠心肌I/R损伤模型和原代心肌细胞缺氧复氧损伤模型来研究SSNX及其主要入血活性成分对心肌能量代谢和心肌细胞凋亡的作用,并研究其对线粒体的保护作用及机制。动物实验的主要研究内容及方法如下：1.建立大鼠心肌I/R损伤模型,初步评价SSNX对心肌I/R损伤的保护作用。主要实验方法为采用NBT染色测定心肌梗死面积,HE染色光镜观察心肌组织病理学改变,紫外可见分光光度法检测心肌酶LDH和CK-MB的漏出,心肌组织MDA的含量及GSH-Px的活力变化。2.在确定SSNX抗心肌I/R损伤作用的基础上,进一步考察SSNX对I/R损伤心肌能量代谢和心肌细胞凋亡的影响。本实验主要采用HPLC法测定心肌高能磷酸物ATP, ADP和AMP的含量并计算总腺苷酸量(TAN=ATP+ADP+AMP)和细胞能荷,评价心肌细胞的能量代谢状态；采用TUNEL法测定心肌细胞的凋亡程度,Western blot实验测定cleaved-caspase3蛋白表达变化。3.考察SSNX对I/R心肌线粒体损伤的影响。本实验首先采用透射电镜观察线粒体超微结构及形态的改变；然后分离制备新鲜线粒体和胞浆部分,分别测定线粒体代谢酶Complex I、Complex IV和柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)的活力,线粒体通透性转换程度及胞浆Cyt c的含量。依据前期对SSNX体内药代动力学和药动学/药效学数据分析研究结果,选择SSNX主要入血活性成分人参皂苷Rgi、Re、丹酚酸A (salvianolic acid A, SAA)、迷迭香酸(rosmarinic acid, RA)、延胡索乙素(tetrahydropalmatine, THP)和脱氢紫堇碱(dehydrocorydaline, DHC)进行细胞水平的实验研究,主要研究内容及方法如下：1.建立大鼠乳鼠原代心肌细胞培养体系,考察Rg1、Re、SAA、RA、THP、 DHC对正常培养心肌细胞活力的影响。在此基础上,建立细胞缺氧或缺氧复氧(hypoxia reoxygenation, H/R)损伤模型,通过测定心肌细胞LDH漏出,细胞活力以及ROS的产生,初步明确各成分对心肌细胞缺氧或H/R损伤的保护作用。2.采用化学发光法测定心肌细胞ATP含量,并进一步分析心肌细胞胞外02和胞内氧O2消耗的情况,考察各成分对缺氧或H/R损伤所致细胞能量代谢障碍的影响。3.采用流式仪分析心肌细胞的凋亡百分数和△Ψm的改变,Western blot实验测定cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2和p-Akt (Ser473)蛋白表达的变化,考察SAA、RA、THP和DHC对H/R损伤所致心肌细胞凋亡的影响。4.采用流式仪分析心肌细胞mPTP开放的程度,Western blot实验测定心肌细胞HKI、mitoHKII、GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达的变化,考察有效成分对H/R损伤导致mPTP开放的影响,并阐明其可能的作用机制。研究结果如下：1. SSNX22.5mg·kg"1和45mg·kg-1可明显减小大鼠I/R损伤心肌梗死面积和降低心肌酶LDH和CK-MB的漏出；并明显改善I/R损伤导致的心肌纤维变性、坏死,心肌细胞间质水肿及炎性细胞的浸润,降低I/R心肌组织MDA的生成和增加GSH-Px活力。2. SSNX45mg·kg-1可明显减少I/R导致的ATP耗竭,并改善心肌细胞能荷状态；同时,SSNX22.5mg·kg-1和45mg·kg-1均能明显降低I/R导致的心肌细胞凋亡,其中45mg·kg-1剂量组能显著降低cleaved-caspase3的蛋白表达。3. SSNX22.5mg-kg-1和45mg-kg-1能够明显减轻I/R导致的线粒体肿胀和维持线粒体的基本形态及基质密度,并且SSNX可明显减少I/R诱导的线粒体Cyt c释放,促进线粒体Complex I酶活力恢复和降低Ca2+诱导的线粒体肿胀速率。4. SAA、RA、THP、DHC可明显抑制H/R损伤所致心肌细胞LDH的漏出,并能增加细胞活力和降低ROS的产生；SAA和RA还可明显增加H/R后心肌细胞ATP水平,但THP和DHC对缺氧和H/R损伤心肌细胞ATP水平均没有表现出明显改善作用。5.Rg1和Re对H/R损伤所致心肌细胞LDH漏出和ATP水平降低未见明显的改善作用,但Rg1和Re对缺氧损伤心肌细胞活力的下降和ROS的产生都具有明显的改善作用,并能明显增加缺氧损伤心肌细胞胞内02的消耗和细胞内ATP水平；同时,Rg1和Re可显著增加心肌细胞p-Akt (Ser473)蛋白的表达。6. SAA、RA和THP能够明显抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡。其中,SAA和RA能够明显改善H/R损伤导致的细胞△甲m下降,但THP对△Ψm没有表现出明显的保护作用；此外,SAA和RA均能明显降低H/R导致的cleaved-caspase3蛋白表达增加,并增加细胞p-Akt (Ser473)蛋白表达,并且SAA还能显著降低Bax/Bcl-2蛋白表达。7.SAA可明显减轻H/R损伤导致的心肌细胞mPTP开放程度,SAA对H/R损伤造成的mitoHKII蛋白表达降低没有明显的改善作用,但可明显增加细胞p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达,并且当Akt信号通路被LY294002阻断后,SAA增加p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达的作用明显降低。综上所述,本研究发现：1. SSNX通过改善心肌能量代谢和抑制心肌细胞凋亡而发挥抗大鼠心肌I/R损伤作用。2. SSNX对I/R损伤心肌线粒体的结构和形态具有保护作用,通过降低Cyt c释放阻断线粒体途径的细胞凋亡,并能促进Complex I酶活力恢复和降低线粒体通透性转换程度,从而降低心肌细胞的不可逆损伤。因此,线粒体保护是SSNX发挥抗心肌I/R损伤作用的重要途径。3.SSNX主要入血活性成分SAA、RA、THP和DHC均具有显著的抗心肌细胞H/R损伤作用,其中SAA、RA和THP是其抗心肌细胞凋亡的物质基础,并且SAA和RA还能够改善心肌细胞的能量代谢,其保护作用可能是通过激活Akt信号通路实现的。4.SAA可能通过增加p-GSK-3β (Ser9)蛋白表达使GSK-3β失活从而降低心肌细胞mPTP开放程度发挥抗H/R损伤作用,且该保护作用是Akt信号通路依赖的。5. SSNX主要入血活性成分Rg1和Re对缺氧损伤心肌细胞具有显著的保护作用,并明显改善心肌细胞的能量代谢状态,其保护作用与Akt信号通路的激活密切相关。