目的：宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤,流行病学和实验研究均表明,高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的持续感染是导致宫颈癌发生的原因之一,但不是唯一因素。叶酸参与DNA的合成和DNA甲基化,其在宫颈癌中的作用日益受到关注。DNA甲基化是目前研究最为广泛的表观遗传学事件,而DNMTl作为这一过程中的关键酶,已被证实与多种肿瘤的发生有关。脆性组氨酸三联基因(Fragile Histidine Triad gene, FHIT)是目前宫颈癌研究中报道最多的抑癌基因之一。其5’端CpG岛的超甲基化可能是其失活的主要机制。已有研究报道,叶酸可影响DNMT1的活性；且补充叶酸可使FHIT蛋白表达升高,但叶酸是否通过DNA甲基化过程而影响宫颈癌细胞中FHIT基因的表达,目前未见相关报道。本次实验将采用体外研究方法对其加以探讨。方法：运用瞬时转染技术将重组质粒和空质粒导入宫颈癌C33A和Caski细胞中,设立未转染组作为对照,分别向未转染组、空质粒组和重组组中添加不同浓度叶酸,采用细胞计数检测宫颈癌细胞的生长情况,流式细胞仪分析细胞的增殖及凋亡情况,Real-time PCR检测DNMT1、EHIT及HPV16癌基因E6、E7mRNA的表达情况,Western—blot法检测DNMT1和FHIT蛋白表达情况。结果：1.叶酸对宫颈癌细胞生长及DNMT1、FHIT基因表达的影响：(1)随着叶酸浓度的增加抑制率呈上升趋势(C33A:r＝0.976,P<0.001:Cask i:r=0.952, P,<0.001),涂10μg/ml浓度组外,实验组与对照组相比均有统计学意义(P<0.05)。(2)施加不同浓度叶酸后,细胞周期增殖指数降低(C33A:r=-0.736, P＝0.001:Caski:r=-0.864,P<0.001)；凋亡率逐渐增加(C33A：r=0.776,P<0.001; Caski:r=0.679, P=0.002)。(3)两种细胞在高浓度叶酸500μ g/ml和1000μg/ml组中DNMT1mRNA和蛋白的相对表达量与1μg/ml组相比有统计学意义(P<0.05)。(4)施加叶酸干预后,C33A细胞中,1μg/ml组FHIT基因甲基化阳性,500和1000μg/ml组FHIT基因甲基化阴性,其余浓度组部分甲基化；Caski细胞中,500μg/ml和1000μg/ml组FHIT基因甲基化阴性,250μ g/ml组FHIT基因部分甲基化,其余浓度组FHTT甲基化阳性。(5)随着叶酸浓度的增加宫颈癌细胞FHITmRNA (C33A:r=0.853, P<0.001, Caski:r=0.919,P<0.001)与蛋白(C33A:r=0.721, P=0.001, Caski:r=0.801, P<0.001)相对表达量呈升高趋势,在500.0、1000.0μg/ml组与对照组[(1μg/ml)相比有统计学意义(P<0.05)。(6)叶酸对Caski细胞HPVE6癌基因mRNA相对表达量无影响；HPVE7癌基因mRNA表达量降低(r=-0.728, P=0.001),1000μ g/ml与对照组相比有意义。2.DNMT1对宫颈癌细胞生长及FHIT基因表达的影响：(1)重组质粒与空质粒经酶切鉴定,分别在291bp和290bp处获得两条重组片段。重组质粒和空质粒成功转染宫颈癌细胞C33A和Caski,转染率为65%和63%,DNMT1基因抑制率为53%和52%。(2)重组组中宫颈癌C33A和Caski细胞活细胞数减少,与未转染组相比有统计学意义(P<0.05)；细胞增殖指数降低,凋亡率升高,与未转染组和空质粒组相比有统计学意义(P<0.05)。(3) DNMT1干扰后,未转染组与空质粒组,FHIT甲基化呈阳性,而非甲基化阴性。重组组中,出现了非甲基化条带,未见甲基化。(4)转染后,重组组与未转染组相比,FHITmRNA与蛋白相对表达量增加，且差异有统计学意义(P<0.05)；空质粒组与未转染组细胞相比表达量无明显差别。(5)DNMT1干扰对Caski细胞HPV16E6癌基因的表达量无明显影响；重组组E7癌基因相对表达量降低,与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。3.叶酸、DNMT1对宫颈癌细胞生长及FHIT基因表达的影响：(1)宫颈癌C33A和Caski细胞中,三组细胞均随着叶酸浓度的增加活细胞数逐渐减少,未转染组与重组组除10μ g/ml组外,与对照组(1μg/ml)相比均月统计学意义(P<0.05)。空质粒组中各实验组与对照组(1μg/ml)相比有统计学意义(P<0.05)。相同叶酸浓度下,重组组与空质粒组,重组组与未转染组相比活细胞数减少,且差异有统计学意义(P<0.05)。(2)细胞增殖,C33A细胞重组组中,随着叶酸浓度的增加周期增殖指数逐渐降低,500μ g/ml和1000μ g/ml组与1μ g/ml组相比有统计学意义(P<0.05)。Caski细胞,空质粒组与重组组细胞均随着叶酸浓度的增加,细胞周期增殖指数逐渐降低,且500μ g/ml和1000μ g/ml组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。相同叶酸浓度下,重组组与未转染组和空质粒组相比,细胞周期增殖指数降低,差异有统计学意义(P<0.05)。随着叶酸浓度的增加,重组组与空质粒组C33A和Caski细胞的凋亡率逐渐升高,除10μ g/ml组外,其它各实验组与1μ g/ml组相比有统计学意义(P<0.05)。相同叶酸浓度下,重组组中两种细胞的凋亡率均较未转染组和空质粒组的高,‘且差异有统计学意义(P<0.05)。(3) FHIT基因甲基化,C33A细胞,空质粒组中1000μ g/ml组FHIT甲基化阴性,500μ g/ml组FHIT基因部分甲基化,其余浓度组中FHIT甲基化阳性；重组组中各叶酸浓度组FHIT基因甲基化阴性。Caski细胞,空质粒组中250μ g/ml、500μ g/ml和1000μ g/ml组FHIT基因非甲基化阳性,其余浓度组FHIT甲基化阳性：重组组FHIT甲基化阴性。(4) FHIT蛋白表达,未转染组和空质粒组细胞FHITmRNA相对表达量逐渐升高,500μ g/ml和1000μ g/ml组与1μg/ml组相比差异有统计学意义(P<0.05)；重组组细胞FHITmRNA相对表达量同样呈上升趋势,各实验组与对照组相比均有统计学意义(P<0.05)；相同叶酸浓度下,重组组细胞的FHITmRNA相对表达量较未转染组和空质粒组的高,且差异有统计学意义(P<0.05)。(5)C33A细胞,三组均随着叶酸浓度的增加,HHIT蛋白表达量上升,未转染组和重组组在叶酸浓度为250μ g/ml、500μ g/ml和1000μ g/ml时,与1u g/ml组相比差异有统计学意义(P<0.05)；空质粒组中500μ g/ml和1000μ g/ml组与1μg/ml组相比有统计学意义(P<0.05)。Caski细胞中,未转染组与空质粒组在500μ g/ml和1000μ g/ml组,FHIIT蛋白表达量与对照组(1μg/ml)相比有统计学意义(P<0.05)。而在叶酸浓度为250μg/ml>500μg/ml和1000μg/ml时,重组组细胞FHIT蛋白表达量与1μg/ml组相比差异有统计学意义(P<0.05)。相同叶酸浓度下,除C33A细胞250μg/ml组和Caski细胞10μg/ml组外,重组组FHIT蛋白相对表达量较未转染组和空质粒组的高,差异有统计学意义(P<0.05)。(6)叶酸干预、DNMT1干扰对宫颈癌Caski细胞HPV16E6癌基因无明显影响；三个组中E7mRNA的表达水平均随着叶酸浓度的增加,表达降低。结论：1.高浓度叶酸可抑制DNMT1表达；使FHIT基因发生去甲基化,FHIT蛋白恢复表达。2.DNMT1基因可影响FHIT基因的甲基化状态及表达。3.补充叶酸、DNMT1表达降低对宫颈癌细胞的生长增殖抑制具有协同作用。4.补充叶酸、DNMT1表达降低可使宫颈癌细胞FHIT基发生去甲基化并恢复表达,二者具有协同作用；DNMT1干扰后再施加叶酸干预,基因表达水平进一步升高,提示叶酸可能通过降低DNMT1表达水平而使FHIT基因表达升高。5.补充叶酸、DNMT1表达降低对宫颈癌Caski细胞HPV16E6癌基因表达无影响,但可降低E7癌基因的表达,对Caski细胞的增殖抑制作用可能与E7癌基因的表达改变有关,但具体机制有待进一步研究。