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目的： DNA甲基化是肿瘤发生的早期分子事件，CpG岛局部甲基化异常早于细胞的恶性增生，因此基因启动子区高甲基化或低甲基化是肿瘤发生早期的一个高度灵敏的肿瘤生物标志物，可通过检测肿瘤相关基因的甲基化状态，为肿瘤的早期诊断、疗效观察及预后判断提供极为重要的信息。新疆哈萨克族食管癌是我区的特高发疾病，基于目前尚无系统的，在肿瘤发生前即可操作的早期预警体系，本课题拟从研究消化道肿瘤早期相关的原癌基因survivin，cdc42与抑癌基因p16，FHIT在哈萨克族食管癌组织中的mRNA差异表达入手，探讨其启动子区CpG岛甲基化状态与基因表达的关系，在此基础上进一步研究基因启动子区甲基化状态的改变对基因表达的调控及对细胞生物学功能的影响，为新疆哈萨克族食管癌早期预警指标体系的建立，早期诊断，治疗和预后提供理论依据。方法：1)哈萨克族食管癌组织中survivin、cdc42、p16和FHIT基因mRNA水平的表达检测：采集新疆哈萨克族食管癌组织及远端无癌组织标本48对，Trizol法提取总RNA，应用半定量RT-PCR技术检测4个消化道肿瘤早期相关基因在食管癌组织及远端无癌组织中的表达；2)哈萨克族食管癌中survivin、cdc42、p16和FHIT基因启动子区CpG岛的甲基化检测：应用Methprimer软件查找survivin、cdc42、p16和FHIT基因启动子区第一个CpG岛，并设计甲基化引物及非甲基化引物，用亚硫酸氢钠修饰基因组DNA之后运用甲基化特异性PCR技术（MSP）检测survivin、cdc42甲基化状态；利用高分辨率熔解曲线技术（HRM）检测p16和FHIT基因启动子区CpG岛甲基化程度，进而探究甲基化状态或程度差异与基因表达的关系；3)survivin及cdc42启动子区CpG岛重组载体的构建及甲基化状态对报告基因CAT活性的影响：重组体的构建：PCR扩增包含survivin、cdc42基因启动子区第一个CpG岛的DNA片段，及任意一段不含CpG岛的random序列，酶切后分组，一组体外甲基化酶修饰，另一组不修饰，分别与酶切的pCAT3-Enhancer载体相连，构建CpG island-pCAT3-Enhancer重组载体，将未甲基化修饰的重组体及pCAT3-Enhancer空载体转化至甲基化酶缺陷的大肠杆菌ER1793（Mcr-、Mrr-）中，将甲基化修饰的重组载体及pCAT3-Enhancer空载体转化至可持续甲基化状态的大肠杆菌JM109中。挑选阳性克隆，测序并检测甲基化程度；重组载体转染至食管癌细胞株Eca109中：将8种载体转染至食管癌细胞株Eca109中，37℃孵育48小时；报告基因氯霉素乙酰基转移酶（CAT）活性的检测：收获细胞，提取CAT基因表达产物，加C14标记的氯霉素后，用薄层层析法测定CAT活性，以此分析survivin，cdc42启动子区CpG岛甲基化对下游CAT活性调控能力的影响，确定基因启动子区甲基化差异对基因表达的影响。结果：1)在48对食管癌组织标本中，癌组织中survivin，cdc42，p16，FHIT阳性表达率分别为87.50%，97.92%，75.00，83.33%，远端无癌组织中阳性表达率分别为58.33%，100.00%，77.08%，85.42%。癌组织与远端无癌组织比较，survivin阳性表达率明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。cdc42，p16，FHIT阳性表达率癌组织与远端无癌组织之间差异无统计学意义（P＞0.05）。survivin mRNA表达水平癌组织明显高于远端无癌组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。cdc42，p16，FHIT mRNA表达水平癌组织与远端无癌组织差异无统计学意义（P＞0.05）；2)在48例食管癌癌组织中，survivin mRNA的表达与淋巴结转移、临床分期、肿瘤侵犯深度具有相关性（r=0.379、0.488、0.393；P=0.017、0.002、0.019），与分化程度无相关性（P＞0.05）。cdc42mRNA表达与临床分期，肿瘤分化程度具有相关性（r=0.452，r=0.325；P=0.003P=0.034），与淋巴结转移及侵润程度之间均无相关性（P＞0.05）。p16mRNA表达与临床分期、分化程度、淋巴结转移及侵润程度之间均无相关性（P＞0.05）。FHITmRNA表达与肿瘤临床分期具有相关性（r=0.338，P=0.035），而与分化程度、淋巴结转移及侵润程度之间均无相关性（P＞0.05）。3)在20对食管癌标本中，癌组织中70%的survivin基因启动子区CpG岛为杂合型甲基化，远端无癌组织中75%的survivin基因启动子区CpG岛为杂合型甲基化，组织间杂合型甲基化状态无明显差异（P＞0.05）。癌组织中有4例甲基化，其对应的mRNA表达水平均大于远端无癌组织；远端无癌组织中有4例甲基化，其对应的mRNA均未表达；4)在20对食管癌标本中，癌组织中有90%c的dc42启动子区CpG岛呈现出甲基化状态，远端无癌组织中有80%呈现为甲基化状态，组织间甲基化状态无明显差异（P＞0.05）。且cdc42启动子区CpG岛甲基化状态与mRNA水平的表达无相关性；5)在20对食管癌标本中，癌组织及远端无癌组织中p16启动子区CpG岛甲基化例数均为20例，甲基化比例100%。p16启动子区CpG岛甲基化水平在癌组织及远端无癌组织无明显差异（P＞0.05）。p16启动子区CpG岛甲基化水平与食管癌组织TNM分期具相关性（r=0.511，P=0.030），与组织分化，侵润程度，淋巴结转移均无相关性（P＞0.05）。与其mRNA高阳性表达相比，甲基化与mRNA水平的表达无相关性；6)在20对标本中，FHIT启动子区CpG岛呈现低甲基化比例及水平。癌组织及远端无癌组织甲基化比例分别为35.00%和30%。甲基化水平均小于10%，且在癌组织及远端无癌组织无明显差异（P＞0.05），甲基化水平与食管癌组织TNM分期，组织分化，侵润程度，淋巴结转移均无相关性（P＞0.05）。与其mRNA高表达比较，提示低甲基化水平可能未影响基因的表达；7)甲基化及非甲基化的pCAT3-Enhancer载体，转染至食管癌细胞株中，甲基化的载体下游报告基因CAT酶的活性显著低于非甲基化的载体；8)甲基化及非甲基化的Random-pCAT3-Enhancer重组载体，转染至食管癌细胞株中，CAT酶的活性均接近阴性水平；9)甲基化及非甲基化的survivin启动子区CpG岛-pCAT3-Enhancer重组载体，转染至食管癌细胞株中，CAT酶的活性均接近阴性水平；10)甲基化及非甲基化的cdc42启动子区CpG岛-pCAT3-Enhancer重组载体，转染至食管癌细胞株中，甲基化的重组载体CAT酶的活性显著低于非甲基化的重组载体CAT酶的活性。结论：1)哈萨克族食管癌癌组织中survivin mRNA水平表达的增高在哈萨克族食管癌的发生、发展过程中起到了一定的作用。4例远端无癌组织中survivin启动子区CpG岛甲基化对应了mRNA的沉默表达，提示在正常组织中启动子区CpG岛甲基化具备调控基因表达的能力。在食管癌细胞株中，survivin启动子区CpG岛的甲基化及非甲基化均导致了CAT的失活。提示在癌组织或癌细胞中，启动子区CpG岛的甲基化可能与基因表达无直接关系，在癌变过程中可能有更多的机制调控了该基因的表达。2)哈萨克族食管癌中cdc42基因mRNA在癌组织和远端无癌组织中阳性表达率及表达水平无差异，提示该基因可能不是参与食管癌发生发展的主要机制。其启动子区CpG岛甲基化状态的阳性率在癌组织和远端无癌组织中也无差异，且甲基化状态与该基因mRNA水平的表达无关。在食管癌细胞株中，cdc42启动子区CpG岛的甲基化降低了下游报告基因CAT酶的活性，而非甲基化使酶保持较高活性。提示cdc42启动子区CpG岛甲基化本身具有调控基因表达的能力，而在哈萨克族食管癌中其启动子区CpG岛甲基化与基因表达无直接关系，说明在癌变过程中可能存在更多的调控机制参与了该基因的表达；3)哈萨克族食管癌中p16mRNA在癌组织和远端无癌组织中均为高表达，p16启动子区CpG岛甲基化比例高达100%，提示p16可能未参与哈萨克族食管癌的发生发展，且甲基化可能不是调控该基因表达的主要分子机制。4)哈萨克族食管癌中，FHIT mRNA在癌组织及远端无癌组织中表达无差异，其启动子区CpG岛甲基化比例及程度均较低，提示FHIT可能未参与哈萨克族食管癌的发生发展，同时低甲基化水平可能未影响FHIT基因的表达。