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微生物源示踪(microbial source tracking, MST)是90年代初美国学者提出一种利用环境中的微生物生化特性、遗传多样性或者其特异性代谢产物确定它的宿主来源,从而识别污染水体中粪便污染源的新的监测技术。主要用于应对人畜粪便对水域环境污染日益加重且久治无效的局面,解决将非点源粪便污染转化为可以控制的点源粪便污染。本课题采用MST检测技术中的rep-PCR技术和电泳技术通过对不同粪便污染源中指示因子(E. coli)的定性分析,总结指纹图谱规律,检验rep-PCR方法是否适合应用于我国水质监测,最终为国家管理部门识别、控制粪便污染源提供科学的理论基础。目的分析不同粪便来源的大肠杆菌rep-PCR指纹图谱规律,检验rep-PCR方法识别粪便污染源在我国水质监测中是否适用。方法本课题大肠杆菌样品采用前期大连海事大学从实验海域、陆源已知污染源分离、生化鉴定纯化后得到的629株大肠杆菌菌株,其中牛源128株,人源159株,鸡源111株,狗源120株,猪源111株；选用E.coli标准菌株ATCC25922为对从样品中分离出的E.coli进行阳性对照。选择合适的E.coli基因组DNA提取方法。取等量样品,分别用酚／氯仿抽提法、CTAB法改良、CTAB法、液氮法、经典SDS方法、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA,用紫外分光光度计(260nm,280nm)分别测定其OD值,进行定性、定量分析。确定合适的提取方法,保证有足够DNA模板进行PCR。rep-PCR反应条件和电泳条件的摸索。对文献中查到的rep-PCR条件进行改良,改变PCR条件、模板加入量、引物浓度等,确定最佳反应条件。ALPHAVIEW 2.0.0软件数据处理。采用ALPHAVIEW 2.0.0软件分析电泳结果,得到电泳结果图片中条带转化为以数字信息,以DNA marker为标准拟合出一条曲线,以此计算出待测菌株条带DNA片段长度,并以标准菌株的信息为对照验证每次结果的一致性。指纹图谱分析。按牛、人、鸡、狗、猪不同来源分类,选取5000bp～100bp之间的条带进行分析,分别依照对数曲线确定每段的组距,共分128组,对电泳结果进行分段统计,扩增产物中分子量不同的DNA条带作为多态性状,分子量相同的条带作为一个相同性状,有性状记为1,无性状记为0,总结各来源大肠杆菌rep-PCR共有条带和特征性条带。对rep-PCR结果进行统计分析。进行聚类分析,建立聚类分析树形图；并分别按照五种来源(牛、人、鸡、狗、猪),两种来源(人、动物),四种来源(牛、鸡、狗、猪)进行判别分析,检验rep-PCR快速鉴别的效果。结果考虑细菌基因组DNA提取结果和操作简便性,选择试剂盒法提取样品DNA,为进一步PCR提供足量可靠的模板。rep-PCR反应体系总结：引物1R(10μM) 2μl、引物21(10μM) 2μl、2×SuperMix 25μl、DNA模板50 ng、加去离子水至50μl；PCR仪反应程序：50μl扩增体系,95℃预变性7 min,94℃变性30s,49.4℃退火1 min,72℃延伸8 min,重复30个循环,最后72℃再延伸16 min。五种来源大肠杆菌在分子量581～590 bp、1251～1300 bp、3001～3200 bp处存在共有条带,不同种动物粪便中大肠杆菌各自具有特征性条带。牛源大肠杆菌独有的特征性条带在分子量801～810 bp、1451～1500 bp、2201～2300 bp、2900～3000 bp处；人源大肠杆菌独有的特征性条带在分子量651～660 bp、771～780 bp、1451～1500 bp、2301～2400 bp处；鸡源大肠杆菌独有的特征性条带在分子量601～610bp、691～700bp、2301～2400bp处；狗源大肠杆菌独有的特征性条带在分子量441～450 bp、521～530 bp、771～780 bp、2901～3000 bp处；猪源大肠杆菌独有的特征性条带在分子量511～520 bp、651～660 bp、1451～1500 bp、2501～2600 bp处。对样品扩增结果进行聚类分析(SPSS 16.0),得到树形图显示分层聚类关系；将样本按照牛、人、鸡、狗、猪不同来源分组,进行判别分析(SPSS 16.0),五组有显著差异(P<0.01),狗源、鸡源、人源、牛源、猪源的RCC值分别为96.7%、98.2%、93.6%、93.7%、92.5%,ARCC值为94.8%；将四种动物宿主(狗源、鸡源、牛源、猪源)来源样品合并为动物组,人源样品归为一组,两组显示出显著的差异(χ2=440.246,P<0.01),人源RCC为86.7%,动物组RCC为90.1%,ARCC下降到89.2%。分析四种动物源(狗源、鸡源、牛源、猪源)大肠杆菌图谱,四组有显著差异(P<0.01),狗源、鸡源、牛源、猪源的RCC值分别为96.7%、94.5%、96.9%、96.2%,ARCC值为96.1%。结论本课题结果显示：不同粪便来源大肠杆菌rep-PCR产物电泳结果存在共有条带,和各自的特征性条带,并且rep-PCR指纹图谱分析方法可以将在我国海域中采集样品中的大肠杆菌正确分组,能达到污染源示踪的要求,适用于我国水质监测。