目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)又称糖尿病(diabetes mellitus,DM)肾小球硬化症,是DM最常见、最严重的微血管并发症之一,随着人们生活水平的提高,饮食结构的变化,我国DN的发病率还在逐年上升,已成为导致终末期肾病的第二位原因,仅次于各种肾小球肾炎。尽管国内外肾脏病学者不断探索DN的发病机制及治疗方法,但目前为止,发病机制尚未明了,也未找到特效的治疗方法。传统中医药以其多环节、多靶点效应的重要优势,在有效防治DN中凸现出很大潜力。近年来中医对DN病机有了更深层次的认识,认为瘀血阻络为其关键病机,贯穿于DN始终,并有临床报道,100%的DN患者存在瘀血阻络的证候特征,因此在众多治疗DN中药复方中化瘀通络药的使用频率最高,一度成为复方的基础用药,并且化瘀药与通络药多联合应用,其疗效也得到诸多医家的广泛认可。但化瘀通络中药具有怎样的作用机制,通过何种途径发挥作用,化瘀药、通络药的靶向特点以及二者之间是否具有协同关系等均有待进一步明确。本研究根据前期的动物实验及临床观察,选用化瘀通络中药全方川芎、丹参、地龙、水蛭、全蝎并按功效组分进行拆方(化瘀药:川芎、丹参;通络药:地龙、水蛭、全蝎两类),采用高糖高脂饲料联合小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射诱导DN大鼠为观察对象,以瘀血阻络和足细胞相关蛋白为主要切入点,通过动物实验及小鼠条件永生系足细胞的离体培养,从多水平、多靶点等不同层面探讨和深化化瘀通络中药延缓DN作用机制和特点,为优化中药配伍,提高临床疗效提供理论依据。方法:1化瘀通络中药不同配伍对DN大鼠瘀血阻络生物学指标的干预作用选用清洁级健康雄性SD大鼠65只,4~5周龄,体重80g~100g,适应性喂养1周后,随机选取10只大鼠作为正常组(C组),其余55只大鼠给予高糖高脂饲料喂养,4周后按35mg/kg腹腔注射1%STZ复制DM大鼠模型,72h后通过尾静脉取血检测大鼠RBG,连续三次血糖≥16.7mmol/L为DM造模成功。成模大鼠按体重随机分为模型组(M组)12只、化瘀通络中药全方组(Q组)12只、化瘀中药组(H组)12只、通络中药组(T组)12只。C组大鼠均腹腔注射相应体积不含STZ的0.1 mol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。DM大鼠造模成功1周后,根据动物体表面积比率换算等效计量法计算各组大鼠用药量,Q组:丹参1.35g/(kg?d),川芎1.08g/(kg?d),地龙0.9g/(kg?d),水蛭0.54g/(kg?d),全蝎0.54g/(kg?d);H组:丹参1.35 g/(kg?d),川芎1.08g/(kg?d);T组:地龙0.9g/(kg?d),水蛭0.54g/(kg?d),全蝎0.54g/(kg?d)。各组药物定容至1ml/100mg体重进行灌胃,同时C组、M组大鼠给以相应量的饮用水。每日喂药1次,连续用药16周后,腹腔注射10%水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉,腹主动脉取血,检测各组大鼠随机血糖、24h尿蛋白定量、血脂、凝血四项、血小板参数、血小板代谢产物等。剖开腹腔,快速切取部分肾皮质保存于4%中性甲醛固定液中,待行后续免疫组织化学检测;切取部分肾皮质,存放入冻存管内,迅速投放到液氮中,短暂冷却后转入-80℃超低温冰箱保存,待行后续分子生物学指标检测。2化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠的肾脏保护作用清洁级健康雄性SD大鼠50只,随机分为正常组10只和造模大鼠40只,造模方法同第一部分,将36只成模大鼠随机分为模型组(M组)12只,化瘀通络中药全方组(Q组)12只,厄贝沙坦组(I组)12只。DM大鼠造模成功1周后,根据动物与人体表面积进行换算计算各组药物剂量,Q组给药量同第一部分,I组给药量:13.5mg/(kg?d),同时C组、M组大鼠给以相应量的饮用水,灌胃方法和时间同第一部分。分别于造模前(0周)、造模第4、8、12、16周末,各组大鼠分别放入代谢笼,自由饮食,收集24h尿液并计算尿蛋白定量,同时记录大鼠体重、进食量、饮水量,于第16周末腹主动脉取血,检测肾功能;称量肾重,计算肾脏指数,留取部分肾皮质,通过光镜、透射电镜检测各组大鼠肾脏病理表现。3化瘀通络中药不同配伍对糖尿病肾病大鼠足细胞裂孔膜相关蛋白podocin、CD2AP、ZO-1的干预作用第一部分实验取材时,切取部分肾皮质保存于4%中性甲醛固定液中,采用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)对足细胞裂孔膜蛋白podocin、CD2AP定位检测;切取部分肾皮质,存放入冻存管内,迅速投放到液氮中,短暂冷却后转入-80℃超低温冰箱保存,通过荧光实时定量反应(Real-Time PCR)检测各组大鼠肾组织足细胞裂孔膜蛋白podocin、CD2AP、ZO-1的基因表达情况。4化瘀通络中药不同配伍对糖尿病肾病大鼠足细胞骨架蛋白a-actinin-4、Synaptopodin的影响第一部分实验取材时,快速留取肾组织标本,-80℃保存,分别采用蛋白印迹法(Western-blot)、Real-Time PCR检测各组大鼠肾组织足细胞骨架蛋白a-actinin-4、Synaptopodin的蛋白及基因表达情况。5化瘀通络中药对高糖刺激下足细胞相关蛋白的干预作用采用体外细胞培养技术,将许可条件下培养的条件性永生化小鼠足细胞分为正常糖组(CG组)、高糖组(HG组)和高糖加药组(HG+Z)组,干预24h、48h、72h后,分别采用免疫细胞化学法(immunocytochemistry,ICC)、Western-blot、Real-Time PCR检测足细胞相关蛋白podocin、CD2AP的表达。结果1化瘀通络中药不同配伍对DN大鼠瘀血阻络生物学指标的干预作用1.1各组大鼠一般状况比较C组:大鼠精神状态良好,反应敏捷,体格健壮,饮食正常,体重稳定增加,二便正常,无大鼠死亡。M组:毛色晦暗干枯,弓背凸出耸毛,肌肉瘦削,反应呆板,少动抱团,尾部静脉、舌质、爪心颜色紫暗,随着时间的延长,症状愈加明显。各中药组:大鼠上述症状均有不同程度减轻。1.2各组大鼠RBG比较16w末,与C组相比,M组及各中药组RBG均明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与M组相比,各中药组RBG差异无统计学意义(P>0.05);中药各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。1.3各组大鼠24h UTP比较16w末,与C组相比,M组及各中药组24h UTP均明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与M组相比,各中药组24h UTP均有明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);中药各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。1.4各组大鼠血脂(TC、TG、LDL-C、HDL-C)的比较16w末,与C组相比,M组及各中药组大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与M组比较,各中药组大鼠血清TC、TG、LDL-C明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);各中药组大鼠血清HDL-C与M组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各中药组组间血清TG比较,由低到高依次为Q组、H组、T组,且Q组与T组比较,差异有统计学意义(P<0.05),Q组略低于H组,但差异无统计学意义(P>0.05),H组稍低于T组,但差异无统计学意义(P>0.05);各中药组间大鼠血清LDL-C比较,由低到高依次为Q组、H组、T组,且Q组与T组比较,差异有统计学意义(P<0.05),Q组与H组比较,差异无统计学意义(P>0.05),H组低于T组,差异有统计学意义(P<0.05);各中药组间大鼠血清TC、HDL-C比较,差异无统计学意义(P>0.05)。1.5各组大鼠血凝指标(PT、INR、APTT、TT、FIB)的比较16w末,与C组比较,M组及各中药组大鼠血浆PT明显缩短,差异有统计学意义(P<0.01);与M组比较,各中药组大鼠血浆PT明显延长,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);中药各组间比较,Q组血浆PT较其他两组延长,与T组比较差异有统计学意义(P<0.05),与H组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与C组比较,M组及各中药组大鼠血浆INR明显减小,差异有统计学意义(P<0.01);与M组比较,仅Q组INR明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);各中药组间大鼠血浆INR差异无统计学意义(P>0.05)。与C组比较,M组及各中药组大鼠血浆APTT明显缩短(P<0.01);与M组比较,Q组、H组大鼠血浆APTT明显延长(P<0.01),T组没有明显变化(P>0.05);中药各组间比较,Q组血浆APTT较其他两组延长,与T组比较差异有统计学意义(P<0.05),与H组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与C组比较,M组及各中药组大鼠血浆FIB明显升高(P<0.05,P<0.01);与M组比较,各中药组均有不同程度降低,差异有统计学意义(P<0.05);中药各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组间大鼠血浆TT比较差异无统计学意义(P>0.05)。1.6各组大鼠血小板参数(PLT、MPV、PCT%、PDW)的比较16w末,与C组比较,M组及各中药组大鼠血清PLT、PDW水平均有明显变化,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与M组比较,各中药组大鼠血清PLT、MPV、PCT%均明显改善,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),与M组比较,仅Q组的PDW明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。各中药组组间比较各指标均无明显差异(P>0.05)。1.7各组大鼠TXB2、6-keto-PGF1a、TXB2/6-keto-PGF1a的水平比较16w末,与C组相比,M组及各中药组大鼠血清TXB2、TXB2/6-keto-PGF1a水平明显升高,6-keto-PGF1a明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与M组比较,各中药组大鼠血清TXB2、TXB2/6-keto-PGF1a水平明显降低,6-keto-PGF1a明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。各中药组组间比较,Q组TXB2、TXB2/6-keto-PGF1a明显低于T组,差异均有统计学意义(P<0.05),其余各组间两两比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠的肾保护作用2.1各组大鼠不同时间点体重的比较造模前(0周),各组大鼠体重比较,差异无显著性(P>0.05);此后C组大鼠体重随时间稳步增加。与C组相比,第4、8、12、16周末,M、Q、I组大鼠体重明显减轻,差异有统计学意义(P<0.01)。M、Q、I三组两两比较,各时间点均无显著性差异(P>0.05)。2.2各组大鼠不同时间点进食量的比较造模前(0周),各组大鼠进食量比较,差异无显著性(P>0.05);此后,C组大鼠摄食量趋于相对恒定。与C组相比,第4、8、12、16周末,M、Q、I组大鼠摄食量明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。M、Q、I三组两两比较,各时间点差异均无显著性(P>0.05)。2.3各组大鼠不同时间点饮水量的比较造模前(0周),各组大鼠饮水量比较,差异无显著性(P>0.05);此后,C组大鼠饮水量趋于恒定。与C组相比,第4、8、12、16周末,M、Q、I组大鼠饮水量明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。M、Q、I三组两两比较,各时间点差异均无显著性(P>0.05)。2.4各组大鼠不同时间点尿量的比较造模前(0周),各组大鼠尿量比较,差异无显著性(P>0.05);此后,C组大鼠尿量趋于恒定。与C组相比,第4、8、12、16周末,M、Q、I组大鼠尿量明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。M、Q、I三组两两比较,各时间点差异均无显著性(P>0.05)。2.5各组大鼠不同时间点24h UTP的检测造模前(0周),各组24h UTP无明显差异(P>0.05);与C组比较,第4、8、12、16周末,M、Q、I组大鼠24h UTP均明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。与M相比,第4、8、12、16周末,Q、I组24h UTP均有明显减少(P<0.05,P<0.01)。Q、I组间比较,仅16周末,Q组改善尤为明显,差异有统计学意义(P<0.05),其余时间点比较差异无显著性(P>0.05)。2.6各组大鼠KI、Cys-c、Scr、BUN、UA的比较16周末,与C组相比,M、Q、I组大鼠KI、Cys-c、Scr、BUN、UA水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与M组比较,Q、I组Cys-c、BUN均有显著改善(P<0.05,P<0.01),KI、Scr、UA无明显变化(P>0.05)。Q、I组间比较,各指标均无显著性差异(P>0.05)。2.7各组大鼠肾组织病理形态学的比较光镜:C组大鼠肾脏结构清晰,毛细血管腔未见扩张,肾小球无肥大或萎缩,基底膜未见增厚,系膜无增生。M组大鼠肾小球体积增大,基底膜弥漫增厚,系膜基质增多,系膜区增宽,肾小囊腔变窄,呈裂隙状,肾小管上皮细胞肥大,肾间质水肿,部分纤维化。与M组相比,两治疗组病理改变均有一定程度减轻。电镜:C组大鼠可见肾小球基底膜结构清晰,均匀无增厚,足突排列较整齐,系膜细胞未见增殖,系膜基质未见增生。M组大鼠基底膜结构欠清晰,均匀弥漫增厚,足突增宽或广泛融合。与M组相比,两治疗组均有不同程度改善,肾小球基底膜节段性增厚,足突部分融合。3化瘀通络中药不同配伍对糖尿病肾病大鼠足细胞裂孔膜蛋白podocin、CD2AP、ZO-1的干预作用3.1各组大鼠肾皮质podocin、CD2AP蛋白表达的定位分析(见Fig.1、Fig.2)C组大鼠podocin局限性分布于肾小球并呈棕黄色染色,主要沿基底膜呈线状分布,肾小管和间质未见明显表达;M组大鼠podocin在肾小球的分布欠均匀,且表达明显减弱;与M组相比,各中药组podocin表达明显增强,沿基底膜线状分布有所恢复。C组大鼠CD2AP主要分布在肾小球并呈棕黄色染色,在肾小管和集合管也有少量表达;M组大鼠CD2AP在肾组织表达明显减弱;与M组相比,各中药组CD2AP表达明显增强。3.2各组大鼠肾组织podocin m RNA的表达结果显示:与C组相比,其余各组大鼠肾组织中podocin m RNA表达明显减少(P<0.01);与M组相比,各中药组肾组织podocin m RNA的表达明显增多(P<0.01);各中药组之间比较,Q组改善最为明显,依次为T组、H组,且Q组与T、H两组比较均有明显差异(P<0.05),T组与H组比较无明显差异(P>0.05)。3.3各组大鼠肾组织CD2AP mRNA的表达结果显示:与C组相比,其余各组大鼠肾组织中CD2AP m RNA表达明显减少(P<0.01);与M组相比,各中药组肾组织CD2AP m RNA的表达明显增多(P<0.01);各中药组之间比较,Q组改善最为明显,依次为T组、H组,且Q、T两组与H组比较均有明显差异(P<0.01),T组与Q组比较差异无统计学意义(P>0.05)。3.4各组大鼠肾组织ZO-1 m RNA的表达结果显示:与C组相比,其余各组大鼠肾组织中ZO-1 m RNA表达明显减少(P<0.01);与M组相比,各中药组肾组织ZO-1 m RNA的表达明显增多(P<0.01);各中药组之间比较,Q组改善最为明显,依次为T组、H组,且Q组与T、H两组比较均有明显差异(P<0.05,P<0.01),T组与H组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。4化瘀通络中药不同配伍对糖尿病肾病大鼠足细胞骨架蛋白a-actinin-4、Synaptopodin的影响4.1各组大鼠肾皮质a-actinin-4、Synaptopodin蛋白表达的定量分析结果显示:与C组相比,其他各组大鼠肾组织α-actinin-4蛋白表达水平均明显降低(P<0.01)。与M组相比,各中药组大鼠肾组织α-actinin-4蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)。中药各组间比较,Q组改善最为明显,依次为T组、H组,且Q、T两组与H组比较均有明显差异(P<0.05,P<0.01),T组与Q组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果显示:与C组相比,其他各组大鼠肾组织Synaptopodin蛋白表达水平均明显降低(P<0.01)。与M组相比,各中药组大鼠肾组织Synaptopodin蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)。各中药组之间比较,Q组改善最为明显,依次为T组、H组,且Q组与T、H两组比较均有明显差异(P<0.05,P<0.01),T组与H组比较差异无统计学意义(P>0.05)。4.2各组大鼠肾皮质a-actinin-4、Synaptopodin m RNA表达的相对定量分析结果显示:与C组相比,其余各组大鼠肾组织中a-actinin-4 m RNA表达明显减少(P<0.01);与M组相比,各中药组肾组织a-actinin-4 m RNA的表达明显增强(P<0.01);各中药组之间比较,Q组改善最为明显,依次为T组、H组,且Q组与T、H两组比较均有明显差异(P<0.05,P<0.01),T组与H组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结果显示:与C组相比,其余各组大鼠肾组织中Synaptopodin m RNA表达明显减少(P<0.01);与M组相比,各中药组肾组织Synaptopodin m RNA的表达明显增强(P<0.01);各中药组之间比较,Q组改善最为明显,依次为T组、H组,且Q组与T、H两组比较均有明显差异(P<0.05),T组与H组比较差异无统计学意义(P>0.05)。5化瘀通络中药对高糖刺激下足细胞相关蛋白的干预作用5.1各组小鼠足细胞podocin、CD2AP免疫组化检测结果显微镜下观察发现,小鼠足细胞podocin、CD2AP蛋白的特异性免疫染色在正常组的足细胞细胞膜、细胞质及细胞核周围呈细颗粒状或线状的强阳性表达;在高糖组的足细胞浆及细胞核周边呈弱阳性表达;在最佳浓度的高糖加药组的表达较高糖组有所增强。5.2各组小鼠足细胞podocin、CD2AP蛋白定量检测结果干预足细胞48h后,与CG组比较,HG组、(HG+Z)组podocin、CD2AP蛋白表达量明显降低(P<0.05,P<0.01);与HG组比较,(HG+Z)组podocin、CD2AP蛋白表达量明显升高(P<0.05);而干预24h、72h后,各组podocin、CD2AP蛋白的表达均无显著差异(P>0.05)。5.3各组小鼠足细胞podocin、CD2AP m RNA检测结果与同时间点CG组比较,HG组、HG+Z组podocin、CD2AP mRNA表达均显著升高(P<0.01);与同时间点HG组比较,(HG+Z)组48h podocin、CD2AP m RNA表达量明显升高(P<0.01),24h、72h与同时间点HG组无明显差异(P>0.05)。结论:1 DN大鼠存在瘀血阻络证的改变,同时化瘀通络中药对其表现出一定改善作用,且化瘀药优于通络药,具有协同作用。2化瘀通络中药能够显著减少DN大鼠24小时尿蛋白,与对照药物厄贝沙坦比较作用更稳定、更持久。3化瘀通络中药能够减少DN大鼠血清尿素氮、胱抑素C,减轻肾组织病理形态学改变,与对照药物厄贝沙坦疗效相当,具有肾保护作用。4化瘀通络中药、化瘀中药、通络中药均可上调足细胞裂孔膜蛋白(podocin、CD2AP、ZO-1)和骨架蛋白(α-actinin-4、Synaptopodin)的表达,明确其均为该中药防治DN的作用靶点之一,且部分指标通络中药优于化瘀中药,两者具有协同作用。5高糖刺激可抑制足细胞相关蛋白podocin、CD2AP的表达,化瘀通络中药对高糖刺激下调podocin、CD2AP的效应有显著拮抗作用。对于本实验结果还有待增加样本量,避免实验干扰因素,改善实验条件等进一步探讨。