研究背景:乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一,严重威胁女性生命健康。我国乳腺癌的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。目前,以手术治疗、内分泌治疗、放化疗为主的综合治疗方法已取得了长足的进步。然而,由于乳腺癌具有浸润性生长、高侵袭性、化疗耐药性及特殊的免疫抑制性肿瘤微环境等不良特征,复发转移仍然是影响乳腺癌生存率和死亡率的主要原因。肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是由肿瘤实质和间质两部分组成,浸润的免疫细胞群、局部表达的独特细胞因子和趋化因子等在肿瘤的发生发展、浸润转移及免疫逃逸过程中发挥着至关重要的作用。文献报道,肿瘤细胞表达的抑制性因子可与肿瘤微环境中的免疫细胞相互作用而调控肿瘤的免疫逃逸。因此,深入探索乳腺肿瘤细胞和肿瘤微环境中免疫细胞的相互作用及肿瘤免疫逃逸机制已成为目前乳腺癌研究的热点。树突状细胞(dendritic cell,DC)是目前已知最强大的抗原递呈细胞,处于调节和维持机体免疫应答的中心环节。CD83是人DC细胞成熟的标志,同时成熟DC细胞还高表达HLA-DR、CD40、共刺激分子CD80和CD86等。正常情况下,成熟DC细胞能有效的捕获、处理抗原并将抗原递呈给特异性T淋巴细胞,激活特异性免疫应答,维持自身的功能稳定。机体抗肿瘤免疫主要由成熟DC细胞和肿瘤微环境中的其他免疫细胞共同介导。成熟DC细胞作用下的初始T细胞极化方向和CD8+T细胞的活化是调节免疫应答的关键,对机体抗肿瘤免疫至关重要。在肿瘤局部微环境中,肿瘤细胞可与DC细胞直接接触,通过某种未知的方式和途径影响DC细胞功能,抑制机体的抗肿瘤免疫。本课题旨在研究乳腺肿瘤细胞通过表达抑制性分子CTLA-4及分泌抑制性细胞因子IL-35对肿瘤微环境中DC细胞成熟及免疫学功能的影响;以及在低氧饥饿的恶劣肿瘤微环境中,乳腺肿瘤细胞通过自分泌和旁分泌IL-35对自身增殖、凋亡、自噬等多种恶性生物学行为的影响及其可能的机制。我们的研究为更深入了解肿瘤细胞与微环境中免疫细胞的相互作用提供了有价值的补充,有助于从微环境为基础的创新角度入手,阐述肿瘤进展和肿瘤免疫逃逸的相关机制。同时,也为乳腺肿瘤的生物治疗和免疫治疗提供了全新的思路和治疗策略,具有重要的理论价值和广阔的应用前景。第一部分CTLA-4+乳腺肿瘤细胞抑制树突状细胞的成熟和功能目的:细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4,CTLA-4),是重要的免疫抑制性受体,主要表达于效应性T细胞和调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)。Treg细胞表面的CTLA-4能与DC细胞表面分子B7结合,通过抑制T细胞增殖活化、阻断细胞周期演进、降低炎性细胞因子的分泌来发挥免疫抑制作用。目前已在许多类型肿瘤中发现CTLA-4的表达,如乳腺癌、结肠癌、肾癌、骨肉瘤等。我们在前期研究中发现,乳腺癌细胞也可表达CTLA-4,且CTLA-4的表达与肿瘤的临床分期和淋巴结转移密切相关。然而迄今为止,CTLA-4在乳腺癌组织中表达的意义尚不明确。表达于乳腺癌细胞表面的CTLA-4是否与Treg细胞表面的CTLA-4具有相似的功能?CTLA-4阳性表达对肿瘤微环境中DC细胞的成熟和免疫学功能有何影响?CTLA-4功能性抗体对CTLA-4+乳腺肿瘤细胞自身的恶性生物学行为是否有直接作用?为回答以上问题,本部分研究将建立CTLA-4+乳腺肿瘤细胞与单核细胞来源的DC细胞共培养体系来模拟体内肿瘤微环境,分析CTLA-4+乳腺肿瘤细胞对DC细胞成熟和功能的影响,包括DC细胞的成熟表型和细胞因子分泌水平,共培养后的DC细胞刺激T细胞增殖的能力、诱导初始CD4+T细胞极化的能力和方向、对CD8+T细胞功能的影响及其分子信号通路,并同时探讨了 CTLA-4功能性抗体治疗对乳腺肿瘤细胞自身生物学行为的影响。方法:1.通过流式细胞术检测乳腺癌细胞表面及胞内CTLA-4的表达并筛选出CTLA-4+乳腺肿瘤细胞。2.利用人外周血单核细胞来源DC细胞与CTLA-4+乳腺肿瘤细胞建立共培养体系。采用流式细胞术、液相悬浮芯片等技术检测共培养体系中CTLA-4+乳腺肿瘤细胞对DC细胞成熟表型和细胞因子分泌水平的影响。3.将CTLA-4+乳腺肿瘤细胞处理后的DC细胞与CD4+/CD8+T细胞共培养,利用CCK-8方法检测CTLA-4+乳腺肿瘤细胞处理后的DC细胞对T淋巴细胞增殖能力的影响。4.将CTLA-4+乳腺肿瘤细胞处理后的DC细胞与初始CD4+T细胞或CD8+T细胞共培养,采用流式细胞术和液相悬浮芯片技术检测CTLA-4+乳腺肿瘤细胞处理后的DC细胞对初始CD4+T细胞极化、CD8+细胞杀伤能力的影响。5.采用western blotting方法检测CTLA-4+乳腺肿瘤细胞影响DC细胞成熟的相关信号通路。6.利用CCK-8、流式细胞术等技术检测CTLA-4功能性抗体对CTLA-4+乳腺肿瘤细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。结果:1.流式细胞术显示CTLA-4在乳腺肿瘤细胞中均有表达,且胞内表达高于胞膜表达。2.CTLA-4+乳腺肿瘤细胞抑制了 DC细胞的表型成熟,主要表现在CD83、CD40、CD80、CD86和HLA-DR表达的下调。但在阻断CTLA-4后,DC细胞的表面标志有不同程度的升高,且细胞因子IL-1β、IL-2、IL-12和TNF-α的分泌水平也显著提高。3.CTLA-4+乳腺肿瘤细胞处理的DC细胞诱导CD4+/CD8+T细胞增殖的能力明显减弱。4.CTLA-4+乳腺肿瘤细胞处理的DC细胞抑制CD4+初始T细胞向Th1方向极化,但对Th2的极化无明显影响,主要表现在CD4+IFN-γ+T细胞比例明显降低,Th1型细胞因子(IL-1β、IFN-y和TNF-α)的分泌水平改变。5.CTLA-4+乳腺肿瘤细胞处理的DC细胞抑制CD8+T细胞颗粒酶B的产生和细胞因子的分泌。6.CTLA-4+乳腺肿瘤细胞抑制DC细胞成熟和功能是通过异常的激活ERK和STAT3通路来实现。7.CTLA-4功能性抗体可直接抑制CTLA-4+乳腺肿瘤细胞的增殖,促进其凋亡,但对细胞周期无明显作用。结论:我们的研究首次证实了乳腺肿瘤细胞表面的抑制性分子CTLA-4可以直接作用于肿瘤微环境中的DC细胞,通过抑制DC细胞的成熟和功能来达到肿瘤的免疫逃逸,而阻断CTLA-4可以恢复DC细胞活性,并直接抑制乳腺癌细胞的恶性生物学行为。本研究揭示了乳腺肿瘤患者免疫功能低下的根本原因,也为肿瘤免疫学及肿瘤免疫治疗的基础和临床研究提供了新思路和线索,为后续的抗肿瘤治疗研究提供了新靶点。第二部分在低氧饥饿状态下肿瘤源性IL-35通过诱导自噬促进乳腺肿瘤细胞的存活目的:自噬(autophagy)是一种通过调节细胞内容物降解和再利用来满足细胞自身代谢需要的过程。这种能量再利用的特殊生存机制在维持细胞自我修复、正常运转和逃避恶劣环境(如炎症、低氧、饥饿等)方面发挥着至关重要的作用。同时,自噬作为一种新型的细胞死亡机制,与凋亡存在密切联系,即在一定程度上细胞可以通过增强自噬来避免凋亡,帮助细胞抵抗恶劣生存环境。乳腺癌是一个典型的实体性肿瘤,随着肿瘤细胞的无限制增殖,肿瘤内部存在广泛的低氧缺血区域。因此,乳腺癌组织中存在着广泛的自噬激活现象,显著增强了其对缺氧营养贫瘠的耐受能力。IL-35是近年来新发现的免疫抑制性细胞因子,属于IL-12细胞因子家族,由EB病毒诱导的基因 3(Epstein-Barr Virus Induced Gene 3,EBI3)和 IL-12α 亚基p35以异二聚体的形式组成。除Treg和Breg外,IL-35也可表达于多种肿瘤细胞,如肺癌、直肠癌、胰腺癌中,且参与肿瘤的发生演进。我们前期研究及本研究结果发现,IL-35不仅高表达于乳腺癌组织的浸润淋巴细胞中,也在乳腺肿瘤细胞中广泛表达,且IL-35可以促进乳腺肿瘤细胞的增殖,对乳腺肿瘤细胞起到一定的保护作用,同时低氧饥饿(hypoxia and serum deprivation,H/SD)状态下乳腺肿瘤细胞表面IL-35的受体表达明显上调。但IL-35是否在低氧饥饿状态下对乳腺肿瘤细胞发挥保护作用?IL-35是否参与低氧饥饿状态下乳腺肿瘤细胞的自噬?目前尚无报道。本部分旨在研究低氧饥饿状态下IL-35对乳腺肿瘤细胞自噬水平的影响及其相关信号通路;低氧饥饿状态下IL-35介导的乳腺肿瘤细胞自噬改变对细胞增殖和凋亡水平的影响。方法:1.利用免疫组化和免疫荧光染色方法检测乳腺癌组织和细胞中IL-35的表达,同时利用流式细胞术检测在正常和低氧饥饿状态下乳腺肿瘤细胞表面IL-35受体的表达。2.采用CCK-8、细胞周期检测、凋亡检测和western blotting等方法检测在低氧饥饿状态下IL-35对乳腺肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。3.采用MDC染色和western blotting方法检测在低氧饥饿状态下IL-35对乳腺肿瘤细胞自噬的影响。4.选用自噬抑制剂3-MA和Baf-AI,通过CCK-8、流式细胞术等方法检测阻断自噬后IL-35对乳腺肿瘤细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。5.利用western blotting方法检测在低氧饥饿状态下IL-35对乳腺肿瘤细胞自噬相关分子信号通路的影响。结果:1.通过免疫组化和免疫荧光染色显示乳腺癌组织和细胞均表达IL-35的两个亚基EB13和1L-12p35,且存在共定位效应。流式细胞术检测显示乳腺肿瘤细胞表达IL-35受体,且低氧饥饿状态下的IL-35受体表达上调。2.在低氧饥饿状态下,IL-35促进乳腺肿瘤细胞的增殖,逆转低氧饥饿导致的细胞周期G1期阻滞,抑制乳腺肿瘤细胞的凋亡,上调cyclinD1、cyclinE1、CDK2和Bcl-2蛋白的表达,下调p27、Bax和cleaved caspase3蛋白的表达,且呈剂量依赖性。3.IL-35在低氧饥饿状态下促进了乳腺肿瘤细胞的自噬。利用自噬抑制剂3-MA和Baf-A1阻断自噬后,IL-35对乳腺肿瘤细胞的保护作用明显减弱,表现为细胞增殖受抑制,凋亡比例增加。4.western blotting结果表明,在低氧饥饿状态下,IL-35可通过下调乳腺肿瘤细胞中p-mTOR、p-AKT和PI3K的表达促进肿瘤细胞的自噬。结论:在本部分研究中,我们证实了 IL-35可组成性、高水平表达于乳腺癌组织和细胞中,并首次证明,在低氧饥饿状态下IL-35可通过抑制mTOR/AKT/PI3K信号通路而诱导乳腺肿瘤细胞自噬,从而促进其增殖、抑制其凋亡。本研究首次报道了这种IL-35促进实性乳腺肿瘤恶性演进的新机制,并为乳腺肿瘤的辅助治疗提供了全新的治疗靶点。第三部分 IL-35抑制树突状细胞的成熟和功能目的:IL-35作为一种重要的抑制性细胞因子,其免疫抑制功能已很明确,不仅能够直接抑制效应性T淋巴细胞的增殖及其细胞因子的分泌,抑制Th17细胞的极化和细胞因子IL-17的产生,促进Treg的增殖。此外,IL-35还能诱导初始T淋巴细胞转变成分泌IL-35的Treg(IL-35 induced regulatory T cell,iTr35),从而级联放大Treg的免疫调节作用。肿瘤源性IL-35可通过募集髓系来源抑制性细胞促进肿瘤血管形成,进而发挥促进肿瘤生长和抑制机体抗肿瘤免疫。我们在前期研究和本研究中发现,IL-35在乳腺肿瘤组织和肿瘤浸润性淋巴组织中高表达,且其表达的水平与临床分期和淋巴结转移密切相关。但是,目前关于IL-35对于肿瘤微环境中DC细胞的影响尚未报道。本研究利用外源性IL-35替代肿瘤自分泌或旁分泌的IL-35作用于人外周血单核细胞来源DC细胞来模拟肿瘤微环境中IL-35对DC细胞作用的体外模型,观察IL-35对DC细胞分化、成熟和免疫学功能的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:1.通过流式细胞术检测DC细胞中IL-35及其受体的表达。2.将IL-35分别作用于DC细胞分化或成熟阶段,利用流式细胞术和液相悬浮芯片技术检测IL-35对DC细胞表型和细胞因子分泌的影响。3.建立IL-35处理的DC细胞与CD4+/CD8+T细胞共培养体系,利用CCK-8技术检测IL-35处理的DC细胞对不同T淋巴细胞亚群增殖能力的影响。4.将IL-35处理的DC细胞与初始CD4+T细胞或CD8+T细胞共培养,采用流式细胞术和液相悬浮芯片技术检测IL-35处理的DC细胞对初始CD4+T细胞极化、CD8+细胞功能的影响。5.利用western blotting方法检测IL-35影响DC细胞成熟和功能的相关信号通路。结果:I.DC细胞本身不能分泌IL-35且外源性IL-35亦不能诱导DC细胞表达和分泌IL-35,但是CD14+单核细胞和DC细胞均有IL-35受体的表达。2.IL-35部分抑制DC细胞的分化,主要表现在分化标志性表型CD1a和CD209的表达部分下调。3.IL-35显著抑制DC细胞的表型成熟和细胞因子的分泌,主要表现为HLA-DR、CD40、CD80、CD86、CD83 的表达下调和细胞因子 IL-1β、IL-2、IL-12p70、IFN-y和TNF-α分泌水平降低。4.与正常对照组DC细胞相比,IL-35处理的DC细胞显著抑制CD4+/CD8+T细胞的增殖,限制初始CD4+T细胞向Th1细胞极化和CD8+T细胞的杀伤能力。5.IL-35主要是通过异常激活STAT1/STAT3和抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路来抑制DC细胞的成熟和功能。结论:在本研究中,我们首次证明,除作用于T细胞和B细胞外,IL-35也可抑制DC细胞的功能,其作用主要表现为抑制DC细胞的成熟,而这种成熟能力受限的DC细胞可进一步抑制T细胞的增殖,并降低初始CD4+T细胞向Th1细胞的极化和CD8+T细胞的杀伤功能,从而进一步降低机体的特异性免疫。IL-35对DC细胞功能的抑制主要是通过异常激活STAT1/STAT3和抑制p38MAPK/NF-κB信号通路来实现的。本课题为肿瘤的免疫逃逸机制研究提供了有力的补充,提示IL-35在肿瘤的发生演进中发挥着重要作用。