FOXM1在胆管细胞癌中调控IDO2介导的色氨酸代谢作用机制研究

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背景胆管细胞癌(cholangiocarcinoma,CCA)是一种在亚洲人群中好发的主要起源于胆管上皮的肝脏恶性肿瘤(约占5-15%),病理类型以腺癌为主。近些年来在全球范围内发病率和病死率呈现增长趋势。然而,由于胆管癌临床症状不明显,多数患者在就诊时已经处于晚期,仅一小部分早期患者可以进行手术治疗。现今,各类靶向和免疫治疗药物在许多肿瘤中取得了理想的临床获益,但对于胆管癌患者仍然无法达到较好的治疗效果。所以,寻求更为有效的潜在靶点和新型治疗方案是目前胆管细胞癌亟需解决的重要问题。色氨酸(Trp)作为人体的必需氨基酸,可以依靠吲哚胺2,3-双加氧酶家族(indoleamine2,3-dioxygenase,IDOs)分级降解为犬尿氨酸(kynureninepathway,KP)。IDO关键酶主要为IDO1、IDO2。在两者的作用下可以于肿瘤微环境中营造色氨酸耗竭状态,导致T淋巴细胞的生长周期发生G1期阻滞,无法发育为成熟的T淋巴细胞。目前,首个IDO 1抑制剂——1-methyltryptophan已被证明可以减轻肿瘤微环境中免疫抑制状态并促进T细胞活性,达到临床获益。然而,色氨酸代谢在胆管细胞癌致病过程中的具体作用机制仍然未知。FOXM1是属于转录因子叉头框家族中的一员,其已经被许多文献报道发现可以在人体正常胚胎组织发育、维持成熟组织的内环境稳态中发挥重要作用。已有研究证实,FOXM1在肝内胆管细胞癌(ICC)组织中显著上调,并可以促进c-Myc、MMP2/MMP9表达从而增加胆管癌细胞的增殖和转移能力。此外,有证据表明高葡萄糖环境可以诱导胆管癌中EGFR/STAT3激活进而导致FOXM1在肿瘤细胞中表达升高,达到维持胆管癌发生发展的目的。另有研究发现,TESC在胆管癌中潜在调控FOXM1表达,并通过影响细胞周期加速胆管癌的增殖。但是,FOXM1是否可以作用于色氨酸代谢过程仍需要进一步的探索和研究。目的本研究将明确FOXM1在胆管癌及癌旁组织中的差异表达,并评估FOXM1表达高低在患者长期预后生存中的临床价值。阐明FOXM1在胆管癌中的功能影响及其介导下的色氨酸耗竭状态对于胆管癌进展的作用机制。评估FOXM1抑制剂联合PD-1抗体在胆管细胞癌治疗中的协同作用。方法利用C57BL/6小鼠原位胆管细胞癌模型,比较正常小鼠以及胆管癌模型小鼠外周血中色氨酸、犬尿氨酸代谢水平。并在胆管癌模型鼠中外源性喂饲色氨酸,使用流式细胞技术分析色氨酸喂饲后胆管癌组织内CD8+T细胞差异浸润情况。收集胆管癌手术标本,比较癌与癌旁组织中IDOs的差异表达情况,明确在胆管癌组织中IDO2特异性高表达。在胆管癌模型的基础上借助腺相关病毒(AAV)在肝脏中敲低IDO2,评估IDO2表达抑制后胆管癌组织中色氨酸代谢水平以及CD8+T细胞浸润情况,明确色氨酸耗竭是由IDO2所介导。通过生物信息学预测发现FOXM1作为重要的转录因子可以与IDO2启动子结合并存在转录调控可能。选取胆管癌手术切除后癌和癌旁组织,比较FOXM1在两两者之间的表达差异。并在此基础上,进一步分析胆管癌组织中FOXM1蛋白表达水平与患者临床预后之间的相关性。利用基因干扰技术在胆管癌细胞中敲低FOXM1,并借助体内外功能实验探究FOXM1差异表达对于胆管癌细胞增殖、侵袭迁移能力的影响。基于CIBERSORT算法,利用TCGA胆管癌测序结果评估各样本中CD8+T细胞浸润水平与FOXM1表达的相关性。使用双荧光素酶报告实验以及CHIP-qPCR检测FOXM1和IDO2在胆管癌细胞中的转录调控关系。后续将FOXM1稳转敲低细胞系的条件培养基与CD8+T细胞进行混培实验,明确FOXM1表达改变后胆管癌色氨酸代谢差异对于CD8+T细胞活性的影响。利用AAV在肝脏中敲低FOXM1后评估胆管癌模型中肿瘤生长情况、色氨酸代谢水平与CD8+T细胞浸润情况,最后,我们将FOXM1抑制剂——盐屋霉素A和PD-1抗体联合使用并进行药效评估,从而明确FOXM1抑制剂+PD-1抗体联合治疗方案在胆管细胞癌中的潜在应用价值。结果通过比较正常小鼠与胆管癌小鼠外周血中色氨酸与犬尿氨酸含量,发现在荷瘤小鼠中存在色氨酸耗竭的现象。并且使用色氨酸喂饲补充后,胆管癌中的CD8+T细胞浸润程度升高,而其他免疫细胞无差异性改变。并且,在胆管癌及癌旁组织样本中通过免疫组化染色证实IDO2在肿瘤组织中特异性高表达,而IDO1表达水平在两者间无明显差异,提示IDO2在胆管癌的色氨酸代谢中发挥主要作用。基于上述结果,利用AAV在肝脏敲低IDO2后观察到胆管癌荷瘤小鼠预后改善,而肿瘤体积无明显缩小。所以,实验结果提示单一靶向IDO2并不能达到较好的疗效,需要探究IDO2的潜在调控机制。通过RT-PCR以及免疫组化等实验证实FOXM1在胆管癌中处于异常上调状态,并且通过体内外功能学实验明确FOXM1以影响ERK1/2的磷酸化水平促进胆管癌细胞的增殖、侵袭迁移活性。CHI-qPCR、双荧光素酶报告实验结果显示FOXM1可以在胆管癌细胞中转录调控IDO2的mRNA表达,从而介导色氨酸耗竭过程。以上证据均提示FOXM1在胆管癌的发展过程中赋于了“免疫+靶向”的双重身份,为潜在的新型治疗靶点。在此基础上,我们创新性地将FOXM1抑制剂(盐屋霉素A)与PD-1抗体联用,通过药效评估发现联合用药物处理组小鼠胆管癌肿瘤体积缩小,正常肝脏体积增大,具有较为理想的治疗效果。结论1.与癌旁组织相比,FOXM1在胆管癌中表达明显上调,并且FOXM1异常高表达提示患者的不良预后。2.胆管癌中FOXM1一方面可通过激活ERK1/2通路影响胆管细胞癌的增殖以及侵袭、迁移能力;另一方面,可以通过对IDO2的转录调控作用介导色氨酸耗竭,从而导致微环境中CD8+T细胞活性降低,促进胆管细胞癌进展。3.在胆管癌模型小鼠中验证盐屋霉素A+PD-1抗体可以发挥协同作用,明确使用该联合治疗方案可显著抑制胆管细胞癌的生长。
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