二甲双胍加速Nrf2降解的肺癌化疗增效研究及AEs预测模型构建

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研究背景非小细胞肺癌(NSCLC)是全球致死率最高的癌种,局部晚期患者的预后差,即使在免疫治疗时代,基于铂类药物的系统性化疗仍然是NSCLC患者行辅助、新辅助治疗的基石。我们的研究发现局部晚期患者疗效和预后受限于肺癌细胞对顺铂的抵抗作用以及伴随化疗产生的各种不良反应事件。寻找克服化疗耐药的低毒性药物以及精准预测并干预化疗不良反应事件能够大幅增效肺癌化疗。在NSCLC中,应对氧化应激的Nrf2轴过度活化会高效清除化疗药物诱导产生的ROS,介导并促进肺癌耐药。二甲双胍因抗癌效应兴起了各种与化疗药的联合用法。本研究团队发现二甲双胍介导的Nrf2蛋白抑制在克服NSCLC耐药中发挥了至关重要的作用。因此,深入了解其分子机制及Nrf2在耐药中的作用将有助于二甲双胍联用顺铂的临床转化。此外,随着学科间的交叉,机器学习模型被应用于疾病风险预测,这意味着利用化疗病人当下高维数据建模预测下一次化疗副作用将成为现实。研究目的1.探索导致肺癌新辅助化疗患者不良预后的因素,明确Nrf2表达波动的模式和多重化疗不良反应事件对肺癌疗效的影响。2.探究二甲双胍降低肺癌Nrf2波动状态作为增效化疗靶点的有效性及其具体分子机制。3.建立基于机器学习算法的化疗不良反应事件预测模型并评估其性能。研究方法1.收集50例肺癌新辅助患者肿瘤样本和临床特征,通过RECIST 1.1标准评估化疗客观缓解情况,通过CTCAE 5.0判断不良反应事件,明确化疗客观缓解率和不良反应事件之间的相互关系及对患者预后的影响;通过免疫组化测定并分析化疗前后配对的肿瘤组织中Nrf2表达的波动水平与化疗反应率及患者预后的关系。2.利用细胞活性试验、凋亡检测、双药协同指数计算和顺铂耐药的裸鼠移植瘤抑制试验等,在体内外层面证明二甲双胍的协同增效作用及其对肺癌Nrf2波动状态的影响;通过基因过表达、沉默分别上调或下调Nrf2/HO-1轴,观察NSCLC细胞的增值、凋亡及线粒体ROS等表型的变化,来明确Nrf2轴介导的抗肿瘤效应;应用western blot技术和免疫共沉淀技术明确二甲双胍作用下Nrf2泛素修饰水平的变化、Ras-Raf-ERK对Keap1/Nrf2/HO-1通路的影响;利用GPS 5.0软件和Phos-tag的磷酸化检测技术等明确影响Nr f2泛素化的潜在磷酸结合位点及调控方式。3.从医院电子档案系统中提取403位肺癌病人共计1659条化疗信息数据,涵盖基线特征、肺癌特征、化疗方案特征、血液指标特征和干预措施特征,利用3种机器学习算法构建化疗不良反应预测模型,实验采用10次5折交叉验证展开,使用ROC曲线、AUC值、校准曲线对模型性能进行评估。结果1.肺癌新辅助SD患者和发生多重不良反应的患者预后不良(p<0.05,log-rank test);发生多重不良反应的患者较未发生者在化疗疗效上有差异(p<0.001,Fisher’s exacttest);新辅助化疗后肺癌组织Nrf2表达较化疗前降低的患者比未降低的患者具有更好的客观缓解率(p<0.05)和更好的总生存期(p<0.05);靶向Nrf2增效肺癌化疗和降低副作用是改善肺癌化疗患者预后的突破点。2.二甲双胍在体内体外实验中均抑制了由顺铂诱导的Nrf2/HO-1轴激活,协同顺铂显著抑制NSCLC增殖并促进凋亡,有效抑制顺铂耐药的NSCLC裸鼠移植瘤增殖;二甲双胍联用顺铂引起ROS在肺癌细胞中大量堆积,促进顺铂诱导的氧化爆发;使用RO S清除剂N-乙酰半胱氨酸或过表达Nrf2/HO-1轴可以阻碍两药联合的协同效应,恢复肺癌细胞内ROS的水平;下调Nrf2或抑制HO-1活性可以增敏顺铂对NSCLC的杀伤效应。3.ERK1/2抑制剂U0126强烈抑制了Nrf2的表达;二甲双胍使Ras/Raf/ERK通路失活,减弱ERK1/2与Nrf2的相互作用,增加了Nrf2蛋白上的泛素修饰,促进了磷酸化Nrf2向非磷酸化状态转变,广泛去磷酸化后的Nrf2泛素修饰增加;ERK1/2是Nrf2的潜在磷酸化激酶,关键性氨基酸磷酸化可能影响Nrf2泛素修饰。4.分别使用随机森林、多层感知机、逻辑回归和和Adaboost,构建了4个独立化疗不良反应预测模型,其中随机森林模型在骨髓抑制、恶液质和肝功能损害的副作用预测任务中均取得了最好的性能,其AUC值分别为0.75、0.74和0.76,并且有最优的校准曲线。结论1.化疗耐药及化疗不良反应局限肺癌患者疗效,其中肿瘤Nrf2水平的波动状态与新辅助患者化疗缓解率和预后相关;多重化疗不良反应事件的发生局限肺癌患者疗效及预后。2.顺铂联用二甲双胍能够降低肺癌Nrf2波动状态,协同增强顺铂在非小细胞肺癌中的杀伤效应,该化疗增效作用与二甲双胍削弱了Nrf2/HO-1轴对顺铂的解毒能力、增强了ROS介导的细胞凋亡相关;二甲双胍通过减弱激酶ERK1/2对Nrf2的相互作用,抑制Nrf2磷酸化,从而恢复Nrf2的泛素化修饰,最终促进Nrf2降解。3.机器学习算法预测化疗不良反应事件的性能优越,可以精准预测真实世界肺癌病人化疗间歇期或下一周期的化疗不良反应事件,推荐利用基于随机森林算法开发预测工具指导临床工作,增效肺癌化疗。
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