背景和目的牙周病是由多种革兰氏阴性菌引起感染性疾病。牙龈卟啉单胞菌是牙周病主要致病菌。脂多糖是牙龈卟啉单胞菌主要毒力因子,对宿主细胞具有破坏作用。因此,细菌感染可引起牙周组织的炎症反应,进而引起牙槽骨的破坏和牙齿脱落。牙周病导致的牙槽骨吸收过程受破骨细胞调控。破骨细胞来源于造血干细胞的单核/巨噬细胞系统。THP-1细胞可分化成成熟的巨噬细胞,进而诱导分化成为破骨细胞。许多细胞因子可以正性或负性调节破骨细胞增殖、存活、分化和功能。M-CSF和RANKL可由成骨细胞或活化的T细胞产生,是调控破骨细胞重要的细胞因子。RANKL可以诱导活化T细胞核因子1(NF/TTc1)的表达。活化T细胞核因子1可以和破骨细胞相关基因如如抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和组织蛋白酶K等结合,参与破骨细胞分化和成熟。MicroRNAs(miRNAs)是一段由19-22个核苷酸组成的非编码的小分子RNA,对基因转录后水平进行调控。microRNAs主要参与调控成骨细胞,破骨细胞以及骨细胞的分化、增殖以及功能,从而参与胚胎期骨质发育和成年骨组织功能的保持。MiR-20a是miR-17-92基因簇的典型代表,miR-17-92基因簇是研究较为广泛的家族之一。文献报道,miR-17-92基因簇在单核细胞分化和成熟中具有关键作用。MiR-17-92基因簇不仅参与骨骼形成过程,而且在保持骨骼功能正常方面具有重要作用。研究表明,许多miRNAs都参与成骨细胞分化、增殖以及形成过程。研究证实,miR-20a可以负性调节BMP信号通路的抑制剂如Bambi和Crim1的表达水平。进一步的研究还发现,miR-20a可以上调BMP2,BMP4,Runx2,OSX/Sp7,Ocn和Opn的表达,从而促进骨形成。近年来,miRNAs在破骨细胞方面的作用受到普遍关注。但是miR-20a对破骨细胞的功能和分化的研究还未见报道。MiR-20a可在多种组织和细胞内高度表达。它通过靶向不同基因,从而调控肿瘤,免疫疾病的发生,骨骼肌肉细胞等的分化,抑制内皮细胞的迁移,受损血管的修复。PPARγ是miR-20a调控一个重要的靶向基因。文献表明,miR-20a表达上调可以导致小鼠表达成脂的PPARγ基因的蛋白水平水平升高。在骨组织的代谢中,miR-20a可以靶向PPARγ基因对成骨细胞分化起到调控作用。抑癌基因PTEN位于染色体10q23区域。在乳腺癌,卵巢癌,肝癌,肠癌中,PTEN也是miR-20a调控一个重要的靶向基因。近年研究已经证实,PTEN在调控细胞一系列活动如增殖,粘附,迁移,入侵,细胞凋亡等信号通路中发挥着重要的作用。本实验分三部分进行,首先检测miR-20a对THP-1细胞生物学性能的影响其中包括转染实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验和细胞增殖实验。其次探讨miR-20a对破骨细胞分化的影响,最后检测在LPS作用下,miR-20a对破骨细胞分化的影响,通过RT-PCR和WesternBlot检测TRAP、NFATc1表达以及靶基因PPARγ,PTEN分子水平和蛋白水平表达情况,方法1.miR-20a对THP-1细胞增殖、周期和凋亡的影响人THP-1细胞在加入含10%FBS的1640培养液中培养,细胞培养至较高密度时,向6孔板各孔加入PMA,使各孔终浓度为1Ong/ml。72h后,细胞贴壁,用PBS轻轻漂洗3次。实验分5组,空白对照组,MimicsNC组,miR-20a mimics组,Inhibitor NC组,miR-20a inhibitor组。根据转染效率评价的结果,转染试剂Libofectamin2000,用于转染各oligo,于转染24h后,收取细胞,用于RT-PCR检测。将上述转染的5组(空白对照组,MimicsNC组,miR-20a mimics组,Inhibitor NC组,miR-20a inhibitor组)细胞种入96孔板中,避光加入CCK-8试剂,酶标仪450nm波长测其OD值,得到数据。细胞转染至48h后,PBS洗细胞,加入细胞70%乙醇固定至少12小时,再次PBS洗细胞,加入1mLPI工作液室温避光染色30分钟。通过FSC/SSC散点图收集细胞,利用Flowjo软件处理。细胞转染至48h后,离心收集细胞,微量离心机转速1000RPM,离心时间5min,弃培养基。用冷PBS洗涤细胞两次(2000RPM,离心时间5min收集细胞)。用400ul的Binding Buffer重悬细胞。在细胞悬液中避光加入5ul AnnexinV-FITC染液,4℃反应15min。反应后再避光加入10ul的PI混匀,4℃反应5min。在1小时内用流式细胞仪检测。2.转染miR-20a,检测破骨细胞分化中TRAP,NFATc1,PPARγ,PTEN基因表达THP-1细胞在10cmdish中培养至较高密度时,再加入含10%FBS的1640培养液,向6孔板各孔加入PMA,使各孔终浓度分别为200ng/ml。3天后,根据转染效率评价的结果,转染试剂Lipofectamin2000,用于转染各oligo。实验分三组,空白对照组,MimicsNC组,Mimic-20a组。6h后换液,并加入M-CSF和sRANK Ligand继续培养,并使各孔两种药物的终浓度分别为25ng/ml、30ng/ml。在加入M-CSF和sRANK Ligand后72h,收取一套复孔进行TRAP染色与计数,一套复孔收取Western样品,一套复孔收取RT-PCR样品。3.转染miR-20a,检测在LPS作用下,破骨细胞分化中TRAP,NFATc1,PPARy,PTEN基因表达THP-1细胞在10cmdish中培养至较高密度时,加入含10%FBS的1640培养液,吹打使细胞形成单细胞悬液。向6孔板各孔加入PMA,使各孔终浓度分别为200ng/ml。3天后,根据转染效率评价的结果,转染试剂Lipofectamin2000,用于转染各oligo。实验分三组,空白对照组,MimicsNC组,Mimic-20a组。6h后换液,并加入M-CSF和sRANK Ligand继续培养,并使各孔两种药物的终浓度分别为25ng/ml、30ng/ml。在加入M-CSF和sRANK Ligand后72h,在三组中加入PG-LPS,使得用药终浓度为1ug/ml,于PG-LPS加药24h收取细胞样品,一套复孔进行TRAP染色与计数,一套复孔收取Western样品,一套复孔收取RT-PCR 样品。结果1、miR-20a对THP-1细胞增殖、周期和凋亡的影响实验中,我们使用CCK8法检测miR-20a对THP-1细胞增殖的影响。结果证实,与空白对照组相比,miR-20a过表达和miR-20a抑制剂均抑制了THP-1细胞的增殖。但是对THP-1细胞的抑制作用在转染后的第三天最为显著。我们检测miR-20a转染THP-1细胞48h后,对THP-1细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果显示,miR-20a过表达组与空白对照组相比,细胞周期中S期的不同具有统计学意义。然而miR-20a抑制组与空白对照组相比,不同在于G1期和S期。我们推论,miR-20a通过延长G1期,缩短了S期,阻滞了G1/S期时相转换,抑制了 THP-1细胞的生长和增殖。进而我们使用流式细胞仪验证miR-20a对THP-1细胞增殖的抑制作用是否是由于MiR-20a促进了THP-1细胞凋亡所致。结果显示,和空白对照组相比,miR-20a转染48h后,miR-20a过表达抑制了早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞,促进了活细胞的增殖。然而miR-20a抑制剂呈现出促进细胞凋亡的趋势。因此,我们得出结论,miR-20a对于THP-1细胞增殖的抑制不是由于抑制细胞凋亡所致,miR-20a对于细胞增殖和细胞凋亡的影响是来源于不同的两个信号通路。2、转染miR-20a,检测破骨细胞分化中TRAP,NFATc1,PPARγ,PTEN基因表达为了证实miR-20a在破骨细胞分化过程中的作用,我们先使用PMA处理THP-1细胞分化为巨噬细胞,再将miR-20a转染至贴壁的巨噬细胞中,在M-CSF和RANKL诱导剂的诱导下继续培养3天,应用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测破骨细胞相关基因TRAP和NFATc1的表达情况。TRAP和NFATc1是破骨细胞分化中具有关键作用的转录因子,研究显示,与空白对照组和NC对照相比,miR-20a过表达组,TRAP和NFATC1的mRNA水平和蛋白水平明显下降,提示在M-CSF和RANKL诱导的破骨细胞分化中,miR-20a起到抑制的作用。本实验选择PPARy作为miR-20a预测的靶基因。为了证实PPARy是否是miR-20a靶向目的基因,我们使用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测了在M-CSF和RANKL诱导破骨细胞分化过程中,miR-20a过表达情况下,PPARy的分子水平和蛋白水平的表达情况。实验结果显示,与空白对照组和NC对照组相比,在RANKL诱导破骨细胞分化过程中,miR-20a下调了 PPARγ基因的mRNA水平和蛋白水平。荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹检测结果发现,与空白对照组和NC对照组相比,在RANKL诱导破骨细胞分化过程中,miR-20a下调了PTENmRNA水平。但是,我们并没有检测到PTEN蛋白水平的变化。因此,我们推测,PPARγ是miR-20a在RANKL诱导THP-1破骨细胞分化中的靶向基因。3.转染miR-20a,检测在LPS作用下,破骨细胞分化中TRAP,NFATc1,PPARγ,PTEN基因表达我们首先使用PMA处理THP-1细胞72h,再将miR-20a转染至贴壁的THP-1细胞中,加入M-CSF和RANKL诱导剂,继续诱导培养3天,加入LPS,24h后应用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测破骨细胞相关基因TRAP和NFATC1的表达情况。TRAP和NFATc1是破骨细胞分化中起关键作用的转录因子,我们研究证实,与空白对照组和NC对照相比,miR-20a过表达组,TRAP,NFATc1的mRNA水平明显升高。我们结果表明,在LPS作用下,miR-20a对RANKL诱导破骨细胞起到促进的作用。本实验采用人THP-1细胞,在PMA诱导贴壁,转入miR-20a-Mimic和NC-FAM,在M-CSF和RANKL诱导THP-1细胞破骨分化72h,加入LPS刺激24h,采用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹法,检测PPARy和PTEN的分子水平和蛋白水平。荧光实时定量PCR结果显示,与空白对照组和NC对照组相比,在M-CSF和RANKL诱导下,PTENmRNA水平和PPARymRNA明显升高。蛋白免疫印迹法检测PTEN和PPARγ蛋白水平,实验发现,相比于空白对照组,在LPS作用下,PPARy蛋白水平明显升高,但是PTEN的蛋白水平与空白对照组相比没有变化。因此,我们推测,在LPS作用下,PPARy仍然是miR-20a的靶向基因,PPARy的上调促进了 THP-1破骨细胞的分化和成熟。结论1、miR-20a抑制细胞增殖,阻滞G1/S时相的转换,对细胞凋亡呈现抑制作用。2、miR-20a对破骨细胞分化具有抑制作用,靶向PPARy基因。3、在LPS作用下,miR-20a对破骨细胞分化具有促进作用,靶向PPARγ基因