丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）的根和根茎是我国传统的中药材,其药材的指标性成分为脂溶性的隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮II A和水溶性的丹酚酸B。促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase,MAPK）级联途径是经典的信号转导模式,在真核生物中高度保守,由MAPK、MAPKK、MAPKKK和MAPKKKK组成,在响应植物非生物和生物逆境的过程中调控植物体内次生代谢物的合成和积累。迄今为止,丹参中的MAPK级联成员还不清楚,其是否调控丹参次生代谢也未见报道。本研究以丹参基因组为基础,鉴定了丹参MAPK级联途径中的各家族成员;以丹参毛状根为材料,对SmMAPK3基因在调控丹参中次生代谢物生物合成的功能进行了分析,进一步探讨了SmMAPK3-SmARF1调控酚酸类物质合成的机制。主要结果如下:1.鉴定了丹参MAPK级联途径中的各家族成员,并明确了其表达模式。基于丹参基因组,本研究鉴定得到6条SmMAPKKKKs、83条SmMAPKKKs、9条SmMAPKKs和18条SmMAPKs基因。基因表达谱结果显示,有6条SmMAPKKKKs、50条SmMAPKKKs、5条SmMAPKKs和11条SmMAPKs基因至少在一种丹参组织中高表达;有2条SmMAPKKKKs、71条SmMAPKKKs、6条SmMAPKKs和16条SmMAPKs基因至少响应一种诱导子的诱导。此外,少数基因同时受到三种诱导子的诱导。SmMAPKs与代谢酶和转录因子的共表达分析表明,18条SmMAPKs基因都可能参与丹参次生代谢物的合成。其中,SmMAPK3最有可能参与调控丹参次生代谢物的合成与积累。2.确定了SmMAPK3基因在丹参中酮类和酚酸化合物合成与积累过程中的功能。通过发根农杆菌ATCC15834介导的遗传转化,获得了过表达SmMAPK3、过表达组成型激活（Constitutively active,CA）SmMAPK3、SmMAPK3 RNA干扰的转基因毛状根。相较于野生型丹参毛状根,SmMAPK3过表达的株系中酚酸类化合物（丹酚酸B和迷迭香酸）的含量显著升高;SmMAPK3-CA过表达提高了丹参酮IIA的含量,但是降低了毛状根中酚酸的积累。RNA干扰SmMAPK3株系中的酚酸类化合物的积累显著降低,丹参酮类物质的含量显著升高。过表达SmMAPK3株系中酚酸类化合物合成相关基因SmCYP98A14、SmHPPR1和SmPAL1的表达量显著升高,RNA干扰SmMAPK3株系中的SmPAL1、和SmRAS1的表达量显著降低。以上结果表明,SmMAPK3是丹参中次生代谢物积累的关键调控因子。3.筛选得到了SmMAPK3的互作蛋白。Y2H和LCI结果表明,SmMAPK3可以与上游SmMAPKK2、SmMAPKK4、SmMAPKK5和SmMAPKK7互作。Y2H结果表明,SmMAPK3可以与上游SmPP2C14互作;可以与下游SmIAA9、SmIAA14、SmARF1和SmJAZ2互作。亚细胞定位、Y2H和LCI结果表明,SmARF1可以与SmMAPK3和SmMAPK3-CA互作。以上MAPK激酶、蛋白磷酸酶、SmMAPK3及其底物构成了丹参次生代谢的调控网络。4.探明了SmARF1基因在丹参酚酸类化合物合成与积累中的作用。通过发根农杆菌ATCC15834介导的遗传转化,获得了过表达SmARF1和过表达SmMAPK3+SmARF1的转基因毛状根。过表达SmARF1降低了丹参毛状根中迷迭香酸的含量,过表达SmMAPK3+SmARF1提高了丹参毛状根中酚酸类化合物的积累。进一步的基因表达分析显示,过表达SmARF1能显著降低SmRAS6、SmRAS1和SmPAL1的表达量。相反,过表达SmARF1+SmMAPK3能显著提高这三个酚酸合成关键酶基因的表达量。GUS染色和EMSA结果表明,SmARF1可以直接与SmPAL1基因启动子上的Aux RE元件结合,并抑制其表达。体外磷酸化结果表明,SmMAPK3-CA可以磷酸化SmARF1。Dual-LUC结果表明,SmMAPK3和SmMAPK3-CA可以缓解SmARF1对SmPAL1基因启动子的转录抑制活性,甚至可以正调控SmPAL1基因的表达。以上结果表明,SmMAPK3可能通过SmARF1正调控迷迭香酸和丹酚酸B的生物合成。综上,本研究结合磷酸化修饰和转录调控阐明了SmMAPK3-SmARF1级联途径调控丹参酚酸类物质合成的分子机制,为通过基因工程技术对丹参进行优良品种选育提供了理论基础。