第一部分人逼尿肌细胞肾上腺素能β₃受体基因亚型细胞的培养前言膀胱过度活动症是一种以尿急症状为特征的征候群，常伴有尿频和夜尿症状，可伴或不伴有急迫性尿失禁。膀胱过度活动症可由多种病变引起，为最常见的一种膀胱功能障碍，是引起尿频、尿急、紧迫性尿失禁等临床症状的最常见原因，严重者还将引起肾、输尿管积水和肾功能损害。以往治疗膀胱过度活动的方法主要有：非药物保守治疗、药物治疗及外科手术治疗，其中抗毒蕈碱的药物治疗是最常使用的治疗急迫性尿失禁及感觉性、运动性急迫性尿失禁的方式。但是传统的抗胆碱能药物，常带来一些副作用，最近研究发现，β-AR能够介导膀胱平滑肌松弛，对维持储尿过程中膀胱良好的顺应性起着关键作用，并且没有明显副作用，国外学者对逼尿肌中β受体的表达和调节机制及其与逼尿肌活动亢进的关系进行了一些探讨，研究结果存在较大差异，国内尚无相关报告。为进一步探讨β-AR亚型在逼尿肌中的功能奠定基础，我们拟采用反义基因（antisense）技术，构建β-AR亚型的RNA干涉质粒体，封闭三种β-AR中的任意两个，得到表达单一亚型的细胞克隆，再进一步进行研究，以确定β-AR激活对逼尿肌细胞的松弛和增殖的影响，并为寻找新的最终解决膀胱逼尿肌活动亢进的治疗方法提供理论依据。材料与方法一、脂质体转染逼尿肌细胞（一）实验材料293FT细胞购自Invitrogen公司；DMEM培养基；100mg/L氨苄青霉素、50mg／L链霉素；10％胎牛血清（四季青公司）；PBS（磷酸盐缓冲溶液）；胰酶／EDTA消化液：Lipofecter脂质体转染试剂；β₁-PGS质粒和β₃-PGS质粒（二）实验器材20ul／200ul／1ml微量移液器和Tip头；酒精灯；废液缸；涡旋振荡器；恒温水浴箱；台式离心机；35mm培养皿；转染管；15ml离心管；观察用倒置显微镜。（三）实验步骤1、细胞传代（1）试验准备：200ul／1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。（2）弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。（3）用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟（37℃，5％CO₂）。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。（4）加入1ml的含血清培养基终止反应。（5）用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。（6）将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。（7）用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶个细胞加入一个35mm培养皿。（8）将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。（9）将培养皿转入CO₂培养箱中培养，第二天转染。2、细胞转染（1）转染试剂的准备A．将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。B．震荡后将试剂放在—20摄氏度保存，使用前还需震荡，。（2）在试管中配制DNA／脂质体复合物方法如下：①在1mL无血清DMEM中分别稀释β₁-PGS质粒和β₂-PGS质粒②旋转1秒钟，再加入β₁-PGS质粒和β₂-PGS质粒——脂质体悬液，旋转。③室温下放置10分钟，使β₁-PGS质粒和β₂-PGS质粒结合在脂质体上。（3）将混合液在室温放置10—15分钟。（4）吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。（5）加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。（6）弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mLβ₁-PGS质粒和β₂-PGS质粒—脂质体复合物，37℃培养5小时。（7）再于每孔中加入含20％FCS的DMEM，继续培养24小时，吸出DMEM—β₁-PGS质粒和β₂-PGS质粒——脂质体混合物加入新鲜10％FCS的DMEM，2mL／孔，再培养48小时。（8）用消化法收集细胞。二、正常传代逼尿肌细胞与转染后细胞的β-AR受体表达鉴定（一）RT—PCR1、主要试剂RNA提取试剂TRIzol Reagent公司产品；总RNA分离试剂为GIBCOBRL公司产品；逆转录试剂SUPERSCREPT^TM Preamplification System Kit为GIBCOBRL公司产品；Dnasei GIBCOBRL公司产品；PCR试剂TaKaRa公司产品；RNA LAPCR^TM Kit（AMV）为TaKaRa公司产品；JM109大肠杆菌感受态菌株购于Takara公司2、主要仪器设备超纯水装置—美国MILLIPORE MILLI-Q；实验室制冰机—德国ZIGERA 2BE-70-35；振荡水浴箱—美国GFL THERMOLAB；超低温冰箱—日本SANYO MDF-U4086S；鼓风干燥箱—中国余姚TDW；旋涡振荡器—美国VORTEX-2 GENE；小型台式离心机—美国SIGMA 1-13PH计—德国WTW inoLab紫外分光光度计—英国PYE-UNICAM／SPECTRONIC UV-310琼脂糖水平板电泳系统—美国BIO-RAD Sub-cell GT通用电泳仪—美国BIO-RAD PowerPac 200／MINI PROTEAN3自动电泳凝胶成像分析仪—美国ALPHAINNOTECH Chemiimager5500台式低温高速冷冻离心机—美国Sigma公司3K30／SORVALL ST-21磁力搅拌器—中国温州DSHK-4电动高压消毒箱—美国HIRAYAMA HVE-50液氮罐—中国成都YDS-10型快速混匀器中国江苏SZ-1超声波清洗器中国昆山KQ-100PE4800／9600／9700型—美国PERKIN-ELMERUNOⅡ／T GRADIENT96（梯度PCR仪）—德国BIOMETRA3、实验步骤（1）正常传代逼尿肌细胞与转染后细胞中总RNA的提取①抽取细胞溶解液至3个管中（eppendorf管，新鲜无菌，每管1ml），置于离心机中4℃12000转离心3分钟。②离心后抽取上清液至3个管中（每管大约1ml），分别加入1／5体积氯仿（200μl）——振荡器振荡——室温静置3分钟——再次离心12000转10分钟。③离心后再次抽取上清液至3个管中（尽量多取上清液，但不要触及中间层的蛋白，各管分别为700μl，650μl，650μl），加750ml异丙醇，振荡器中振荡—静置5分钟—14000转离心15分钟。④离心后弃上清，加400μl75％冷乙醇（用DEPC水配制，-20℃保存）—14000转5分钟—弃去上清—静置10-15分钟（盖上面巾纸，直至无乙醇味）——加入DEPC20μl（去处RNA分解酶）——弹两下——轻度离心——弹两下——轻度离心。⑤1％低熔点琼脂糖凝胶鉴定RNA的含量及完整性。（2）RT-PCR引物的设计与合成根据Genebank提供的三种β-AR基因序列（NM₀00024）采用Oligo6.6软件设计引物，扩增目的基因。引物序列如下：β₁-AR正义引物：5′-CGGGCAATGTGCTGGTGA-3′反义引物：3′-GGAAGGCGATGGTCTCGGAC-5′反应产物长度：287bpβ₂-AR正义引物：5′-GAGCCTGCTGACCAAGA-3′反义引物：3′CAATCCGTAGTAGTACCC-5′反应产物长度：414 bpβ₃-AR正义引物：5′-GCCTTCGCCTCCAACAT-3′反义引物：3′-TCCAATACGGTTAAGACGG-5′反应产物长度：415 bpbeta-actIn序列如下：正义引物：5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′反义引物：3′-CCTTGCCACTTCCACTGT-5′反应产物长度：187bp（3）RT-PCR扩增β₃-AR全长cDNART反应：反应体系—25mm／μl Mgcl₂ 4μl，10×Buffer缓冲液2μl，10mm／μl dNTP 2μl，随机引物（Random，宝生物制）1μl，下游引物（R0l）1μl，RNase（inhibitor，40U／μl）0.5μl，反转录酶（AMV，5U／μl）1μl，在冰中放置的总RNA+水8.5μl。反应条件—30℃10min→42℃45min→98℃5min→4℃保存PCR反应：反应体系—10×LA Buffer(Mg²⁺)5μl，2.5mm／μI dNTP 8μl，LA 0.5μl，引物1（上游引物，Fol）0.5μl，引物2（下游引物，Rol）0.5μl，dH₂032.5μl，RT反应液（template）3μl。反应条件—94℃1min→98℃10s；55℃30s；72℃1分15秒；35个循环→4℃保存。PCR产物用铝箔纸包好存放于-20℃。（4）电泳检测2％琼脂糖凝胶电泳，条件为80V，60～90分钟，至溴酚蓝前沿走至胶底部。自动电泳凝胶成像分析仪分析结果。（二）免疫蛋白印迹杂交（Western blot）1、主要试剂（1）鼠单克隆抗体p27（Santa Cruze公司）（2）ECL试剂盒（Santa Cruze公司）（3）辣根过氧化酶标记羊抗鼠二抗（4）硝酸纤维素膜（PVDF）膜（5）超厚滤纸（Bio-Rad公司）（6）DC Protein assay试剂盒（Bio-Rad公司）2、主要仪器超声波细胞破碎仪—德国Dr．hielscher GmbH UP 50H紫外透射仪—英国UVItec STX—20M电动匀浆器—德国Heidolph DIAX 900真空冷冻干燥机—德国CHRIST ALPHAI-4半干转印仪—美国Bio-Rad公司Seimidry transfer system水平摇床—美国GFL自动封膜仪Shandon Citadil 2000组织脱水机—美国；Leica 1516石蜡切片机—美国；医用微波炉—中国宁波；Olympus Bx40显微镜—日本；医用烤箱—中国宁波；Olympus AX70倒置显微镜—日本：3、实验步骤（1）蛋白质样品的制备①将培养皿中的培养液收集在15ml离心管中，用细胞刮子刮除生长在皿底的细胞，在室温条件下用PBS冲洗后也收集在同一离心管中，4，000转，4℃离心5分钟，弃去上清，下面的操作均在4℃冰浴冷的蛋白裂解缓冲液。②在每管中加入蛋白裂解缓冲液0.25ml，并用加样器反复混匀，冰浴30分钟后，12，000rpm，4℃离心15分钟，收集上清，分装后保存于-70℃。（2）SDS-PAGE电泳①将玻璃板用清洗剂洗净，晾干。配制12％的分离胶，将分离胶注入玻璃板夹层中，上面流出灌注积层胶所需空间（梳子的齿长再加上1cm）。用吸管在胶面上覆盖一层超纯水，保持胶面平整。将凝胶垂直放置在室温下。②待分离胶完全聚合后（30分钟），倾出覆盖层的液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺。配置好一定浓度的浓缩胶（5％），将其直接灌注在已聚合的分离胶面上，立即在浓缩胶中插入干净的梳子，小心避免混入气泡，在加入浓缩胶液以充满梳子间的空隙，将凝胶垂直放置在室温下。③待浓缩胶完全聚合时，将待分析的蛋白质样品置于1XSDS凝胶加样缓冲液中，在100℃加热5分钟使蛋白质变性，插入冰浴冷却后上样。④在电泳槽中加入电泳缓冲液，小心拔出上样梳，然后用注射器洗干净加样孔，用微量加样器分别吸取待分析样品，至孔的2／3体积。⑤加样完毕后，接通电源，起始时用低电流，当样品在浓缩胶部分浓缩成一条直线，进入分离胶后，将电源电流提高，继续电泳直至溴酚蓝指示剂到达分离胶底部边缘时即可停止电泳。⑥从电泳装置上卸下玻璃板，放在纸巾上，撬开两层玻璃，取出凝胶，切角作记号（3）转膜①将电泳后的胶取出浸入转移缓冲液中，水平摇床缓慢摇30分钟，裁取相同大小的硝酸纤维素膜（PVDF），甲醇浸透，弃去甲醇后浸入蒸馏水中，再将PVDF膜浸入转移缓冲液中5分钟。②用转移缓冲液浸湿一张厚滤纸，铺于半干转印仪的底层电极板上，将PVDF膜铺于滤纸上，勿留气泡，将凝胶贴于PVDF膜上，不留气泡，润湿另一张滤纸，盖在凝胶上，用玻璃棒赶去气泡。盖上顶层电极板，接通正负极电源，15V转印30分钟。（4）杂交①取出PVDF膜，1XTBS洗一次，和胶相邻面向上浸入封闭液中置于水平摇床缓慢摇1小时。②倒掉封闭液，用洗膜液略洗一下，加入用杂交液按1：400稀释的一抗（分别为抗β₁-AR抗体、抗β₃-AR抗体和抗β-actin），在摇床上室温杂交2小时。取出PVDF膜，用洗膜液洗3次，每次10分钟。③倒掉洗膜液，加入用杂交液按比例（1：30000）稀释的二抗，摇床上杂交1小时。取出PVDF膜，用洗膜液洗3次，每次10分钟。（5）化学发光反应（ECL）：①倒掉洗膜液，将PVDF膜夹于吸水纸中，吸去多余的液体，转膜时和胶相邻的一面向上，铺于玻璃板上。②将ECL试剂盒内的detection reagent 1与detection reagent 2等体积混合后，均匀滴在PVDF膜上，反应1分钟。夹起PVDF膜，用吸水纸吸去多余液体。用保鲜膜包好PVDF膜，固定于片夹内，准备曝光。（6）洗片：裁好底片，大小与膜相当，压片。显影3分钟，水中漂洗几次，定影10-15分钟，清水冲洗，根据显影时间，确定下一张片子的曝光时间。（7）将胶片放入自动电泳凝胶成像分析仪进行数据分析。实验结果1、RT-PCR鉴定脂质体转染逼尿肌细胞结果电泳结果显示：与空载体转染的逼尿肌及未被转染的正常传代的逼尿肌细胞相比，β₁-AR和β₂-AR干涉分子转染逼尿肌细胞中β₁-AR，β₂-ARmRNA表达显著减少，β-actin mRNA表达无显著差异，说明RNAi对β₁-AR、β₃-AR mRNA表达抑制是特异性的。光密度扫描结果显示pGC-β₁-ARi转染细胞与空细胞相比β₁-ARmRNA表达抑制率可达77％，pGC-β₃-ARi转染细胞与空细胞相比β₂-ARmRNA表达抑制率可达79％。2、蛋白电泳鉴定脂质体转染逼尿肌细胞的结果通过Westem印迹检测了β-AR蛋白表达的变化，蛋白电泳结果显示：与阴性对照空载体转染的逼尿肌及未被转染的正常传代的逼尿肌细胞相比，β₁-AR和p₂-AR干涉分子转染的细胞中蛋白表达水平显著下降，而两者的β-actin蛋白表达无显著差异，说明RNAi抑制β-AR蛋白的表达是特异性的。光密度扫描结果显pGC-β₁-ARi和pGC-β₂-ARi的抑制率分别为83％和87％。结论我们已经成功地完成了肾上腺素能β-AR单一基因亚型的细胞系的建立，这就为以后的实验奠定了实验基础。第二部分异丙肾上腺素对人逼尿肌细胞β—肾上腺素能受体单一基因亚型细胞cAMP水平的影响前言β肾上腺素能受体是一种G蛋白偶联的跨膜受体，G蛋白是一种由α、β、γ三个亚单位构成的异三聚体，βAR激活后可以使G蛋白Gs异三聚体解离成Gsα和Gsβγ，Gsα可激活腺苷酸环化酶，使ATP降解为cAMP，cAMP作为第二信使可激活蛋白激酶A（PKA），使其催化亚单位与调节亚单位分离，催化亚单位能磷酸化细胞内关键的靶蛋白，参与调解细胞内水平，产生生物学效应，从而使逼尿肌松弛。因此cAMP信使系统是β-AR受体在细胞内一个重要的信息传导通路，cAMP水平的高低也可以作为β-AR受体功能的一种表现，为此，我们观察了非选择性β-AR激动剂异丙肾上腺素分别对于三种β-肾上腺素能受体单一基因亚型的逼尿肌细胞的作用结果，我们以期通过测定细胞内cAMP水平的变化来评价β-肾上腺素能受体亚型的功能。材料与方法一、实验材料1、DMEM培养基；100mg／L氨苄青霉素、50mg／L链霉素；10％胎牛血清（四季青公司）；PBS（磷酸盐缓冲溶液）；胰酶／EDTA消化液；2、cAMP放射免疫试剂盒购于北京环亚泰克生物医学技术有限公司，试剂盒内含（1）¹²⁵Ⅰ-cAMP 1瓶内含185KBq纸片一张（2）cAMP标准2瓶每瓶320pmol。（3）cAMP抗血清2瓶，每瓶0.8ml，2—8℃保存（4）EDTA 1瓶0.3g。（5）分离剂：1瓶，每瓶50ml，用前摇匀，2—8℃保存。3、异丙肾上腺素(10^-6mol／L)购于Sigma公司试剂配制：使用时，各种试剂都用三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（TE）配制。（1）异丙肾上腺素(10^-6mol／L)用缓冲液稀释成10^-7、10^-8、10^-9和10^-10mol／L共4个浓度（2）0.05mol／l三羟甲基氨甲烷（Tris）缓冲液，PH=7.5内含0.004mol／1EDTA。简称TE缓冲液。称约1.21克Tris和0.298克EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）溶于150毫升蒸馏水中，先用稀盐酸调PH近7.5，加水至近200毫升，再调PH至7.5并加水至刻度，存冰箱（3）标准cAMP每瓶320 pmol。临用时用TE缓冲液溶解。其浓度为400pmol／ml，稀释液冰冻保存可用2周。（4）(¹²⁵Ⅰ)-cAMP标记物，比活度大于740GBq／mmol。放化纯度大于98％。临用时用TE缓冲液稀释（约0.37KBq／30μl）稀释液4℃保存可用1周。二、主要仪器设备1、离心机-美国GFL THERMOLAB2、水浴箱-美国MILLIPORE MILLI-Q3、SN-682放射免疫γ计数器-日本SANYO MDF-U4086S4、超低温冰箱—德国Dr．hIelscher GmbH UP 50H5、台式低温高速冷冻离心机—美国SIgma公司3K30／SORvALL ST-216、磁力搅拌器—中国温州DSHK-4三、实验方法1、将原代培养的膀胱逼尿肌细胞，空载体转染的逼尿肌细胞和经过鉴定的β肾上腺素能受体单一基因亚型细胞克隆分别加入100μl异丙肾上腺素(4个浓度组—10^-7、10^-8、10^-9、10^-10mol／L)2、用超声细胞破碎仪破碎细胞（30s×5次），12000r／min 4℃离心10 min，然后分别吸取上清液留用。3、cAMP的测定按cAMP放射免疫试剂盒说明书进行：（1）取标准cAMP一瓶，内含cAMP320pmol，加TE缓冲液0.8ml溶解成400pmol／ml溶液（a）。（2）稀释如下：取小试管6只，每管加0.4毫升TH缓冲液。在第一管加入0.4毫升溶液（a），混匀，得200pmol／ml溶液。（3）然后依次将上一管溶液0.4毫升加入后一管中，得一系列cAMP的标准溶液：400、200、100、50、25、12.5、6.25pmol／ml。（4）按照表1进行加样，各标准管含TE缓冲液稀释的各级cAMP标准品100μl，¹²⁵Ⅰ-cAMP100μl以及抗cAMP血清100μl。非特异管不含抗cAMP血清和cAMP标准品，以TE缓冲液200μl代替。零管以TE缓冲液100μl代替cAMP标准品。待测样品为经过异丙肾上腺素处理过的各类型逼尿肌细胞上清。（5）充分混匀后，置37℃水浴箱中温浴2小时。（6）除总T管外其余各管分别加入1000μl分离剂充分混匀，4℃3600r／min离心20分钟。（7）负压吸去上清液，用全自动放射免疫γ计数器测沉淀的放射脉冲数（cpm），作标准曲线，读取cAMP值。实验结果细胞内cAMP水平在异丙肾上腺素(10¹⁰～10^-10mol／L)作用下呈剂量依赖性升高，当异丙肾上腺素（ISO）浓度超过10^-8mol／L时，可见明显升高cAMP的效应，最大作用见于10^-7mol／L。β₁、β₂、β₃三种基因亚型的逼尿肌细胞产生了不同的cAMP水平，而且在ISO各个浓度(10^-7、10^-8、10^-9、10^-10mol／L)以β₃—受体亚型的逼尿肌细胞产生的cAMP水平最高。讨论膀胱过度活动症是一种以尿急症状为特征的征候群，常伴有尿频和夜尿症状，可伴或不伴有急迫性尿失禁。膀胱过度活动症可由多种病变引起，为最常见的一种膀胱功能障碍，是引起尿频、尿急、紧迫性尿失禁等临床症状的最常见原因，严重者还将引起肾、输尿管积水和肾功能损害。患者生活质量低下，极为痛苦，但其发病机理不清，缺乏有效的治疗方法。最近研究发现，β-AR能够介导膀胱平滑肌松弛，对维持储尿过程中膀胱良好的顺应性起着关键作用，并且没有明显副作用。近年来用逆转录聚合酶链反应等方法研究证实人类膀胱平滑肌存在3种肾上腺素能β受体亚型，β1、β2、和β3。Igawa等发现异丙肾上腺素对逼尿肌的松弛作用在正常膀胱和低顺应膀胱、逼尿肌反射亢进膀胱基本相同，而选择性β₃AR激动剂对低顺应性膀胱的舒张作用较正常膀胱降低。β₃AR激动剂能松弛离体人膀胱逼尿肌，而β₁AR及β₂AR激动剂不能介导逼尿肌舒张，非选择性βAR激动剂异丙肾上腺素介导逼尿肌舒张作用能被β₃AR拮抗剂抑制，而β₁、β₂AR拮抗剂不能抑制异丙肾上腺素的舒张作用，提示β₃ AR可能是调节人逼尿肌舒张的主要βAR亚型。Morita等认为β₂-AR激动剂也有逼尿肌松弛作用。究竟哪一种β-AR亚型介导逼尿肌松弛仍待进一步研究。β肾上腺素能受体是一种G蛋白偶联的跨膜受体，G蛋白是一种由α、β、γ三个亚单位构成的异三聚体，βAR激活后可以使G蛋白Gs异三聚体解离成Gsα和Gsβγ，Gsα可激活腺苷酸环化酶，使ATP降解为cAMP，cAMP作为第二信使可激活蛋白激酶A（PKA），参与调解细胞内水平，产生生物学效应，从而使逼尿肌松弛。因此cAMP通道系统对于介导肾上腺素β受体的逼尿肌舒张功能起着重要的作用，肾上腺素β受体通过增加cAMP水平来完成对逼尿肌的舒张作用，本研究分别采用反义基因技术，得到含有一种β-AR表达的逼尿肌细胞，然后用非选择性β-AR激动剂异丙肾上腺素处理细胞以消除激动剂亲和性和效能差异造成的影响，采用放射免疫检测法测定，确定β-AR激活对逼尿肌细胞的松弛和增殖的影响，及其信号途径和调节机制。从本实验中可以看到细胞内cAMP水平呈异丙肾上腺素剂量依赖性升高，而且通过反义技术得到的β₁β₂β₃三种基因亚型细胞的cAMP水平同样呈Iso剂量依赖性增长，而且可以看到以β₃—受体亚型的逼尿肌细胞产生的cAMP水平最高，从而可以说明β₃受体亚型在介导逼尿肌的松弛过程中起着更为主要的作用，而其它两种受体则起着从属的作用，当然cAMP增加水平仅是判断各受体功能的指标之一，此外还包括AC活性和细胞膜电流和电位等等其他一些方面，需要我们进一步试验去证明，为阐明β受体在膀胱逼尿肌活动亢进中可能发挥的作用，并为寻找新的最终解决膀胱逼尿肌活动亢进的治疗方法提供理论依据。结论β₃受体亚型在介导逼尿肌的松弛过程中起着更为主要的作用，而其它两种受体则起着从属的作用，这就为膀胱功能障碍的药物治疗提供了理论基础。