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目的:
视网膜色素变性(retinitispigmentosa,RP)是一种由于基因突变引起视网膜光感受器细胞变性凋亡的遗传性眼病.该病主要表现为视力进行性下降、视野缩窄、夜盲、眼底色素沉着以及视网膜电图(ERG)异常,是眼科常见的一种遗传性视网膜疾病,具有明显的家族遗传倾向.近年来,国内流行病学调查研究显示我国的RP发病率为1/3784,高于世界平均水平.据此保守估计,我国约有50-70万RP患者.迄今为止,已发现70多个与RP相关的致病基因,但由于对大多数基因突变的致病机制不甚明了,目前尚缺乏十分有效的治疗方法.目前的研究结果显示基因治疗是未来可靠的治疗方式.CRISPR/Cas9基因编辑系统自发现以来因其定位精确,设计方便而得到广泛应用.因此,我们拟使用腺相关病毒载体,设计靶向编辑rd1小鼠Pde6b基因突变位点Y347X的sgRNA,通过CRISPR/Cas9基因编辑系统来治疗rd1小鼠模型.
方法:
1、Pde6b-sgRNA构建及体外活性验证
根据Pde6b-Y347X突变基因位点,利用麻省理工学院CRISPRDesign软件设计sgRNA,并和pX330-Neo质粒连接,克隆得到表达sgRNA和spCas9的质粒.利用电转的方法转入rd1小鼠骨髓间充质干细胞内.通过抗生素筛选出成功导入质粒的骨髓间充质干细胞,提取DNA,利用引物PCR得到Pde6b靶序列,通过T7E1酶切验证Pde6b-sgRNA切割活性.
2、腺相关病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统体内活性验证
根据体外验证活性的sgRNA构建AAV2/8-Pde6b-sgRNA-dsRED.将AAV2/8-Pde6b-sgRNA与AAV2/8-spCas9(病毒滴度1013)以2∶1的比例混合,共0.5微升.通过视网膜下腔注射到rd1P2天小鼠.注射后7天解剖眼球得到视网膜,通过荧光显微镜观察腺相关病毒表达情况.并提取视网膜蛋白,利用蛋白印迹法检测Cas9蛋白的表达.同时提取视网膜DNA,对打靶序列及预测脱靶序列PCR产物进行深度测序.测序结果利用IVG软件分析处理.
3、腺相关病毒介导的CRISPR/Cas9基因治疗rd1小鼠
(1)眼底照相及眼底荧光造影(FFA)
注射后14天检测小鼠表型.将小鼠麻醉后置于小鼠固定支上.使用托吡卡胺滴眼液散瞳,角膜表面涂抹凝胶,利用MicronIV眼底成像系统观察小鼠眼底的变化.经腹腔注射荧光素钠,待荧光扩散至视网膜血管后,观察记录小鼠视网膜血管造影成像结果.
(2)视网膜电图
小鼠充分暗适应后,使用托吡卡胺滴眼液散瞳,并在眼表滴甲基纤维素(2%),以保持角膜湿润.将参考电极和接地电极分别插入小鼠头部双眼及尾巴根部的皮下,调整MicronIV-ERG探头(角膜电极)使得小鼠待测眼与角膜电极恰当接触,并调整小鼠位置使视乳头处于镜头中心.仪器与小鼠连接好以后开始梯度光强刺激,依次记录视杆细胞反应、视锥细胞反应的电生理信号.
(3)免疫荧光染色
分离小鼠视网膜,经过固定、脱水、包埋等一系列步骤后,制备成组织包块.使用冰切机做连续切片,最终选取视神经附近的视网膜组织切片,进行染色处理.选取视网膜视杆细胞特异的Rhodopsin和Pde6b(C端)及视锥细胞特异的M/S-opsin和Cone-arrestin抗体进行染色.将免疫荧光染色切片放于共聚焦显微镜下选取特定的激光通道进行成像.
结果:
(1)pX330-U6-Pde6b-gRNA-spCas9质粒成功转入骨髓间充质干细胞内,T7E1跑胶结果显示除原有完整长度大小的条带外还有两条切割条带,条带大小为491bp和161bp,证明设计的sgRNA具有切割活性;
(2)通过荧光蛋白的检测发现视网膜下腔注射了腺相关病毒混合液的视网膜表达红色荧光,且切片结果发现荧光主要在外核层表达,证明AAV-sgRNA-dsRED成功转染感光细胞,WesernBlot证明注射后视网膜内存在spCas9蛋白,证明AAV-spCas9病毒在转染视网膜内成功表达.深度测序结果显示打靶序列基因出现缺失和替换,表明所设计sgRNA可利用Cas9蛋白在体内进行基因编辑,其辑效率为47%左右,同源修复效率为4.8%;
(3)眼底照及荧光造影结果显示基因治疗小鼠更少的脉络膜透见.免疫荧光染色发现治疗组外核层核层增多,其中存活的视锥细胞更多,同时具备较好的外节结构.ERG结果显示有部分恢复趋势.在低刺激强度下,治疗眼在明反应和暗反应中,b波振幅均高于对照眼.尤其在高刺激强度下,治疗眼明反应和暗反应b波振幅显著提高,与对照眼之间存在统计学差异.
结论:
AAV介导的CRISPR/Cas9系统可以成功的对新生小鼠视网膜进行基因编辑,并部分恢复rd1小鼠视功能,延缓视网膜感光细胞凋亡进程.为未来进一步的临床基因治疗提供可行的策略.
视网膜色素变性(retinitispigmentosa,RP)是一种由于基因突变引起视网膜光感受器细胞变性凋亡的遗传性眼病.该病主要表现为视力进行性下降、视野缩窄、夜盲、眼底色素沉着以及视网膜电图(ERG)异常,是眼科常见的一种遗传性视网膜疾病,具有明显的家族遗传倾向.近年来,国内流行病学调查研究显示我国的RP发病率为1/3784,高于世界平均水平.据此保守估计,我国约有50-70万RP患者.迄今为止,已发现70多个与RP相关的致病基因,但由于对大多数基因突变的致病机制不甚明了,目前尚缺乏十分有效的治疗方法.目前的研究结果显示基因治疗是未来可靠的治疗方式.CRISPR/Cas9基因编辑系统自发现以来因其定位精确,设计方便而得到广泛应用.因此,我们拟使用腺相关病毒载体,设计靶向编辑rd1小鼠Pde6b基因突变位点Y347X的sgRNA,通过CRISPR/Cas9基因编辑系统来治疗rd1小鼠模型.
方法:
1、Pde6b-sgRNA构建及体外活性验证
根据Pde6b-Y347X突变基因位点,利用麻省理工学院CRISPRDesign软件设计sgRNA,并和pX330-Neo质粒连接,克隆得到表达sgRNA和spCas9的质粒.利用电转的方法转入rd1小鼠骨髓间充质干细胞内.通过抗生素筛选出成功导入质粒的骨髓间充质干细胞,提取DNA,利用引物PCR得到Pde6b靶序列,通过T7E1酶切验证Pde6b-sgRNA切割活性.
2、腺相关病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统体内活性验证
根据体外验证活性的sgRNA构建AAV2/8-Pde6b-sgRNA-dsRED.将AAV2/8-Pde6b-sgRNA与AAV2/8-spCas9(病毒滴度1013)以2∶1的比例混合,共0.5微升.通过视网膜下腔注射到rd1P2天小鼠.注射后7天解剖眼球得到视网膜,通过荧光显微镜观察腺相关病毒表达情况.并提取视网膜蛋白,利用蛋白印迹法检测Cas9蛋白的表达.同时提取视网膜DNA,对打靶序列及预测脱靶序列PCR产物进行深度测序.测序结果利用IVG软件分析处理.
3、腺相关病毒介导的CRISPR/Cas9基因治疗rd1小鼠
(1)眼底照相及眼底荧光造影(FFA)
注射后14天检测小鼠表型.将小鼠麻醉后置于小鼠固定支上.使用托吡卡胺滴眼液散瞳,角膜表面涂抹凝胶,利用MicronIV眼底成像系统观察小鼠眼底的变化.经腹腔注射荧光素钠,待荧光扩散至视网膜血管后,观察记录小鼠视网膜血管造影成像结果.
(2)视网膜电图
小鼠充分暗适应后,使用托吡卡胺滴眼液散瞳,并在眼表滴甲基纤维素(2%),以保持角膜湿润.将参考电极和接地电极分别插入小鼠头部双眼及尾巴根部的皮下,调整MicronIV-ERG探头(角膜电极)使得小鼠待测眼与角膜电极恰当接触,并调整小鼠位置使视乳头处于镜头中心.仪器与小鼠连接好以后开始梯度光强刺激,依次记录视杆细胞反应、视锥细胞反应的电生理信号.
(3)免疫荧光染色
分离小鼠视网膜,经过固定、脱水、包埋等一系列步骤后,制备成组织包块.使用冰切机做连续切片,最终选取视神经附近的视网膜组织切片,进行染色处理.选取视网膜视杆细胞特异的Rhodopsin和Pde6b(C端)及视锥细胞特异的M/S-opsin和Cone-arrestin抗体进行染色.将免疫荧光染色切片放于共聚焦显微镜下选取特定的激光通道进行成像.
结果:
(1)pX330-U6-Pde6b-gRNA-spCas9质粒成功转入骨髓间充质干细胞内,T7E1跑胶结果显示除原有完整长度大小的条带外还有两条切割条带,条带大小为491bp和161bp,证明设计的sgRNA具有切割活性;
(2)通过荧光蛋白的检测发现视网膜下腔注射了腺相关病毒混合液的视网膜表达红色荧光,且切片结果发现荧光主要在外核层表达,证明AAV-sgRNA-dsRED成功转染感光细胞,WesernBlot证明注射后视网膜内存在spCas9蛋白,证明AAV-spCas9病毒在转染视网膜内成功表达.深度测序结果显示打靶序列基因出现缺失和替换,表明所设计sgRNA可利用Cas9蛋白在体内进行基因编辑,其辑效率为47%左右,同源修复效率为4.8%;
(3)眼底照及荧光造影结果显示基因治疗小鼠更少的脉络膜透见.免疫荧光染色发现治疗组外核层核层增多,其中存活的视锥细胞更多,同时具备较好的外节结构.ERG结果显示有部分恢复趋势.在低刺激强度下,治疗眼在明反应和暗反应中,b波振幅均高于对照眼.尤其在高刺激强度下,治疗眼明反应和暗反应b波振幅显著提高,与对照眼之间存在统计学差异.
结论:
AAV介导的CRISPR/Cas9系统可以成功的对新生小鼠视网膜进行基因编辑,并部分恢复rd1小鼠视功能,延缓视网膜感光细胞凋亡进程.为未来进一步的临床基因治疗提供可行的策略.