论文部分内容阅读
胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,世界卫生组织公布的报告显示,世界胃癌年发病率为13.86/10万人,位居所有肿瘤致死率的第二位,中国是胃癌高发病国家,胃癌年患病率和死亡率均是世界平均水平的2倍以上,因此,研究胃癌的发病机制及药物作用靶点成为全球的研究热点。心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP),具有正常的生理调控舒张血管平滑肌、增加血管通透性、降压、利尿和调节水盐平衡等生理作用,有日本学者早期研究显示ANP对肺癌细胞侵袭转移有抑制作用,而关于ANP对胃癌细胞的作用尚未见报道。胃癌的发生和发展是一个很复杂的过程,认为与信号通路的异常改变有关,有研究表明胃癌的发生发展,转移及预后不良与PI3K/Akt信号通路过度激活密切有关,有研究报道PI3K/Akt信号通路的抑制剂可抑制胰腺癌细胞的侵袭和转移。细胞骨架巢蛋白Nestin与肿瘤的侵袭性生长,转移有关。然而,细胞骨架巢蛋白Nestin对胃癌细胞侵袭性生长,转移的影响了解甚少,那么细胞骨架巢蛋白Nestin对胃癌细胞侵袭转移的影响是否受ANP及PI3K/Akt信号通路影响的研究国内外尚未见报道,因此,本实验以人胃癌细胞MGC-803为研究对象,应用ANP,PI3K特异性抑制剂(LY294002)及ANP联合LY29400作用于胃癌MGC-803细胞来探讨ANP对胃癌细胞增殖和迁移的影响,并进一步研究ANP是否通过调控PI3K/Akt信号通路对细胞骨架巢蛋白Nestin产生影响进而抑制胃癌细胞的增殖和迁移。本研究的目的为研究胃癌的发生机制提供新的思路;为ANP成为胃癌细胞增殖、转移的抑制剂提供实验依据;为细胞骨架Nestin成为药物作用的潜在药物作用靶点提供理论依据。本研究分两个部分进行:第一部分ANP对人胃癌细胞MGC-803增殖、迁移的影响目的:本研究以人胃癌细胞MGC-803为实验对象,探讨ANP和PI3K特异性抑制剂LY294002对MGC-803细胞增殖和迁移的影响。方法:1.采用CCK-8法检测不同浓度的ANP(10-5mol/L、10-6 mol/L、10-7mol/L)处理MGC-803细胞12h、24h、48h对MGC-803细胞的增殖活性的影响。2.采用CCK-8法检测不同浓度的LY294002(10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L)处理MGC-803细胞24h、48h、72h对MGC-803细胞的增殖活性的影响。3.实验分组:对照组,ANP组,LY294002组,ANP+LY294002组分别处理MGC-803细胞48h,CCK-8法检测各组细胞的增殖活性。4.对照组,ANP组,LY294002组,ANP+LY294002组分别处理MGC-803细胞48h,在倒置显微镜下,观察比较四组细胞数目和形态的差异。5.对照组,ANP组,LY294002组,ANP+LY294002组分别处理MGC-803细胞48h,应用划痕实验检测细胞迁移能力的差异。结果:1.CCK-8法结果显示ANP能抑制MGC-803细胞的增殖活性,并呈时间-剂量依赖性。2.CCK-8法结果显示LY294002能显著抑制MGC-803细胞的增殖活性,并呈时间-剂量依赖性。3.CCK-8法结果显示ANP和LY294002联合应用比二者单独应用时对MGC-803细胞的增殖抑制作用更显著。4.显微镜下观察,发现对照组MGC-803细胞贴壁良好生长;与对照组比较,ANP组MGC-803细胞贴壁生长的细胞数目减少,状态稍差;LY294002组MGC-803细胞与对照组比较,生长严重受限,表现为部分细胞回缩甚至破裂悬浮状态;ANP+LY294002组与二者单独应用组比较MGC-803细胞生长受限更显著,细胞碎裂并出现异常细胞形态。5.划痕实验结果显示ANP能抑制MGC-803细胞的迁移;LY294002也能抑制MGC-803细胞的迁移;ANP和LY294002联合应用比二者单独应用时对MGC-803细胞迁移的抑制作用更显著。小结:1.ANP对人胃癌细胞MGC-803的增殖有抑制作用并呈现出时间-剂量依赖性关系,且ANP对人胃癌细胞MGC-803的迁移也有抑制作用。2.ANP和LY294002联合作用于人胃癌细胞MGC-803,与二者单独应用时相比,对MGC-803的增殖、迁移的抑制作用增强。第二部分ANP抑制胃癌细胞MGC-803增殖和迁移与PI3K/Akt信号通路及细胞骨架巢蛋白Nestin之间的关系目的:根据第一部分实验结果,进一步分析ANP对人胃癌细胞MGC-803细胞发挥抑制作用与PI3K/Akt信号通路及细胞骨架巢蛋白Nestin之间的关系方法:1.实验分组:对照组,ANP组,LY294002组,ANP+LY294002组分别处理MGC-803细胞48h,采用免疫细胞化学法对各组中巢蛋白Nestin及PI3K/Akt信号通路关键蛋白总Akt(t-Akt)、Akt(Ser473)的磷酸化(p-Akt-Ser473)进行检测。2.对照组,ANP组,LY294002组,ANP+LY294002组分别处理MGC-803细胞48h,采用Western Blot检测各组中巢蛋白Nestin及PI3K/Akt信号通路关键蛋白总Akt(t-Akt)、Akt(Ser473)的磷酸化(p-Akt-Ser473)表达水平的差异。3.实验结果的数据应用软件SPSS 19.0进行统计分析。结果:1.免疫细胞化学分析结果和Western Blot结果均显示巢蛋白Nestin及PI3K/Akt信号通路关键蛋白总Akt(t-Akt)、Akt(Ser473)的磷酸化蛋白(p-Akt-Ser473)在MGC-803细胞中均有表达。2.与对照组比较,ANP组和LY294002组均下调了巢蛋白Nestin及PI3K/Akt信号通路关键蛋白Akt(Ser473)的磷酸化(p-Akt-Ser473)表达水平。ANP+LY294002组与ANP组,LY294002组比较,Nestin和p-AktSer473的表达量最低。LY294002显著增强了ANP下调巢蛋白Nestin的表达及抑制Akt的磷酸化(p-Akt-Ser473)的作用。3.对照组,ANP组,LY294002组,ANP+LY294002组四组间细胞t-Akt蛋白的表达均无差异。小结:1.ANP可抑制PI3K/Akt信号通路、下调细胞骨架巢蛋白Nestin进而抑制胃癌细胞MGC-803的增殖、迁移。2.ANP联合LY294002增强了抑制PI3K/Akt信号通路、下调细胞骨架巢蛋白Nestin进而抑制胃癌细胞MGC-803的增殖、迁移作用更加明显。结论1.ANP对人胃癌细胞MGC-803的增殖、迁移有抑制作用,因此ANP可作为抑制胃癌细胞增殖、迁移的抑制剂。2.ANP可通过抑制PI3K/Akt信号通路下调细胞骨架巢蛋白Nestin进而抑制胃癌细胞MGC-803的增殖、迁移,因此细胞骨架巢蛋白Nestin可作为治疗胃癌的潜在药物作用靶点。3.通过研究ANP通过抑制PI3K/Akt信号通路下调细胞骨架巢蛋白Nestin进而抑制胃癌细胞MGC-803的增殖、迁移,为研究胃癌的发病机制提供新的思路。4.ANP联合LY294002增强了抑制PI3K/Akt通路下调细胞骨架巢蛋白Nestin抑制MGC-803的增殖、迁移,为联合靶点抑制剂治疗胃癌提供了新的思路。