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本文主要从以下三个部分展开论述： 第一部分:脂多糖诱导的小胶质细胞激活对14-3-3蛋白表达变化的研究 目的:观察14-3-3蛋白在小胶质细胞中的表达及脂多糖诱导后的表达变化。 方法:脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导剂量100ng/ml,以BV-2细胞作为小胶质细胞的体外细胞模型,LPS作用BV-2细胞后,分别收集细胞和细胞上清,用免疫荧光、流式细胞仪、免疫印迹法(Western blot)检测细胞中14-3-3蛋白的表达,ELISA法测定细胞上清中白细胞介素1-β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,酶法测定细胞上清中一氧化氮(NO)的含量。 结果:LPS诱导小胶质细胞激活,大量释放炎性细胞因子IL-1β、TNF-α及NO,与静息的小胶质细胞相比IL-1β、TNF-α、NO分别在6小时、2小时、12小时达高峰(P<0.01),并持续至24小时,同时14-3-3蛋白表达水平下降(P<0.05)。 结论:在LPS诱导的小胶质细胞激活中,14-3-3蛋白的表达减少,同时IL-1β、TNF-α及NO的分泌增加。14-3-3蛋白在小胶质细胞的活化过程中发挥了作用。 第二部分:14-3-3蛋白过表达对LPS诱导的BV-2细胞分泌IL-1β、TNF-α、iNOS的影响 目的:观察14-3-3蛋白在小胶质细胞中的过表达对脂多糖诱导的小胶质细胞激活及释放IL-1β、TNF-α、iNOS的影响。 方法:用脂质体2000(Lipofectamine2000)转染pcDNA3.1(+)14-3-3ε质粒到BV-2细胞中,再用LPS作用于小胶质细胞,设未转染的细胞为对照组,免疫印迹法(Western blot)检测转染效率。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、iNOSmRNA的表达。ELISA法测定细胞上清中白细胞介素1-β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,酶法测定细胞上清中一氧化氮(NO)的含量。 结果:pcDNA3.1(+)14-3-3ε质粒转染组14-3-3蛋白表达明显高于未转染组(P<0.01)。14-3-3蛋白过表达的BV-2细胞,LPS的激活作用受到抑制,IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、iNOSmRNA的表达较未转染的对照组下降(P<0.05)。细胞上清中 IL-1β、TNF-α、NO分泌减少(P<0.05)。 结论:14-3-3蛋白的过表达可以减轻LPS诱导的小胶质细胞的激活,下调IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、iNOSmRNA的表达,减少IL-1β、TNF-α、NO的释放。 第三部分:BV-2细胞激活的条件培养液对SH-SY5Y细胞凋亡的影响14-3-3蛋白抑制小胶质细胞激活的NF-κB途径探讨 目的:观察BV-2细胞激活的条件培养液对SH-SY5Y细胞凋亡的影响。14-3-3蛋白对BV-2细胞核转录因子(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)-DNA活性的影响。 方法:以SH-SY5Y细胞作为多巴胺能神经元细胞模型,用LPS激活BV-2细胞和14-3-3蛋白过表达BV-2细胞后的细胞上清作为条件培养液(Microglia conditioned medium, MCM;14-3-3 protein overexpression Microglia conditioned medium, OMCM),处理SH-SY5Y细胞,并设空白对照组,应用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测SH-SY5Y细胞存活率,磷脂结合蛋白(AnnexinⅤ)-碘化丙啶(PI)双染色流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞凋亡。应用凝胶电泳迁移率实验( electrophoretic mobility shift assay, EMSA)测定小胶质细胞中NF-κB-DNA的结合活性。 结果:与空白组相比,受MCM处理的SH-SY5Y细胞,存活率明显下降,细胞凋亡率增加(P<0.01),受OMCM处理的SH-SY5Y细胞,其存活率较MCM组上升,细胞凋亡率下降(P<0.01)。而单独用LPS作用于SH-SY5Y细胞,其存活率及凋亡率与空白组相比无明显差别(P>0.05)。LPS诱导BV-2细胞激活后,BV-2细胞的NF-κB-DNA的结合活性明显提高(P<0.01)。在LPS诱导的14-3-3蛋白过表达BV-2细胞中NF-κB-DNA的结合活性明显下降(P<0.01)。 结论:活化的小胶质细胞释放致炎性细胞因子对多巴能神经元具有损伤作用。14-3-3蛋白通过下调NF-κB-DNA的结合活性,抑制LPS诱导的小胶质细胞激活,减轻致炎性细胞因子对多巴胺能神经元的损伤作用。