植物病毒引起的病毒病害是农业安全生产中威胁极为严重的病害之一,素有“植物癌症”之称,对农作物的品质和产量造成极大的破坏和损失。由于植物病毒的种类繁多、易传播和缺乏有效的农药等因素,致使农业生产上植物病毒病害极难防治。因此,深入研究植物与病毒之间的互作关系,不仅在解析病毒的致病机理和寄主抗病机制等方面具有重要的理论意义,同时也在为寻找农作物抗病毒病害新基因、新途径,确保我国农作物生产安全上有着一定的实践意义。芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus,TuMV）寄主种类广泛,在世界各地均有传播,其导致的病毒病害对蔬菜等农作物生产安全造成严重的威胁。叶绿体是多种植物免疫信号分子（如SA和ROS）的来源地,在植物抗病毒过程中行使十分重要的功能。目前,在TuMV侵染植物的分子机制方面已经取得较好的进展,但其与叶绿体之间的相互作用仍然知之甚少。为此,本研究依托经典的TuMV--本氏烟（Nicotiana benthamiana）亲和互作体系为模型,以本实验室前期建立的TuMV侵染本氏烟前后的转录组数据为基础,开展了以下研究工作:1.对转录组数据进行生物信息学分析发现,本氏烟编码叶绿体NAD（P）H脱氢酶复合体（NAD（P）H dehydrogenase-like（NDH）complex）M亚基的基因（Ndh M）在TuMV侵染后表达显著下调。通过实时荧光定量PCR（quantitative reverse transcription-PCR,q RT-PCR）进一步检测了NbNdhM基因在TuMV侵染本氏烟后不同时间点的表达水平,发现其表达在病毒侵染后有一个先上升后下降的变化趋势,暗示了NbNdhM在响应病毒侵染时可能有一个动态的变化过程。利用烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术系统沉默NbNdhM基因后,发现该基因的沉默不影响植株的正常生长发育,但接种TuMV后发现,与对照相比,在沉默NbNdhM的植株上,病毒侵染症状变得更加严重,且病毒积累量明显增加。与之相反,超表达NbNdhM的转基因本氏烟植株则表现出对TuMV的抗性。为进一步揭示NbNdhM在病毒侵染循环过程中的作用,使用TuMV-GFP侵染性克隆质粒对NbNdhM的沉默和过表达植株的原生质体进行转染。q RT-PCR结果表明,沉默NbNdhM的原生质体中TuMV RNAs的积累量增加,相反,过表达NbNdhM的原生质体中TuMV RNAs的积累量则减少。这些研究结果说明,NbNdhM能够正向调控本氏烟对TuMV的抗病性,并且该过程是通过抑制病毒的复制来发挥作用。2.分析发现,NbNdhM是一个核编码的叶绿体蛋白,在其N端含有一个叶绿体转运肽（chloroplast transport peptide,c TP）结构域,而C端则存在一个Ndh M superfamily结构基序,并且其中包含一个核输出信号序列（nuclear export signal,NES）。亚细胞定位的实验显示,NbNdhM不仅定位在叶绿体,而且还能够定位在细胞核、细胞外周和叶绿体的质体微管（stromules）。另外,过表达NbNdhM可以诱导叶绿体在细胞核周边的聚集,并且其NES中的3个亮氨酸是影响这种叶绿体聚集的关键位点。先前研究证实,叶绿体核周聚集与植物的抗病性相关,并且这种叶绿体聚集需要活性氧（Reactive oxygen species,ROS）和肌动蛋白分别作为触发信号和运动支撑。我们检测NbNdhM沉默植株和过表达植株中病程相关基因Nb PRs（Nb PR1、Nb PR2和Nb PR5）的表达情况发现,Nb PRs在NbNdhM沉默植株中的表达与对照相比均明显下调,而在NbNdhM转基因植株中Nb PRs均呈现上调表达。同时,为了明确NbNdhM诱导的叶绿体核周聚集对TuMV侵染的影响,使用肌动蛋白抑制剂Cytochalasin D（CTD）和ROS清除剂Dimethylthiourea（DMTU）处理过表达NbNdhM的植株,结果发现植物细胞发生叶绿体核周聚集的百分比显著降低,并且其对TuMV的抗病性也明显被削弱。此外,瞬时表达缺失c TP或NES的NbNdhM突变体将不能再抑制TuMV的侵染。以上研究结果表明,NbNdhM通过诱导叶绿体在细胞核周围的聚集参与了对TuMV的抗性。3.在长久的自然进化过程中,植物与病毒之间彼此建立了相对应的攻防策略。为了进一步揭示NbNdhM与TuMV之间的互作关系,通过酵母双杂交（yeast two-hybrid,Y2H）、荧光素酶互补成像（luciferase complementation imaging,LCI）、双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation,Bi FC）和免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP）等技术手段发现并证实了NbNdhM与TuMV的VPg蛋白之间存在互作关系,并且其NES中的3个亮氨酸是互作的关键位点。在此基础上对不同植物寄主的Ndh M与不同马铃薯Y病毒属病毒的VPg互作关系进行分析,发现二者的互作在自然界中具有普遍性。随后,共定位结果表明,TuMV VPg不仅能与NbNdhM共定位于细胞核,而且能将其携带进入细胞核仁,增加其在细胞核中的积累量。同时,在VPg存在的情况下,NbNdhM诱导的叶绿体核周聚集明显受到影响。此外,研究发现水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）的p2蛋白也能够与NbNdhM互作,且抑制其诱导的叶绿体核周聚集。这些结果表明,Ndh M可能是被多种植物病毒所攻击的靶标,且病毒通过编码相应的蛋白以互作的方式抑制其诱导的叶绿体核周聚集所介导的抗病性。综上所述,本研究揭示了NbNdhM可能通过介导细胞核周围叶绿体的聚集防御TuMV的侵染,为了对抗这种效应,病毒通过编码VPg蛋白以互作的方式来阻遏这种叶绿体的防御作用。同时,这也体现了植物病毒与叶绿体在长期“军备竞赛”中共同进化的特性,为深入了解叶绿体在植物病毒侵染过程中的作用提供了新的视角与参考。