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NKG2D是表达在NK和CD8+T细胞表面的关键活化性受体,肿瘤细胞表面高表达的MICA分子(小鼠为RAE-1)是NKG2D的配体之一。IL-15是促进NK和CD8+T细胞增殖、活化及存活的重要细胞因子。课题组在前期工作中,利用基因工程技术,分别制备了重组人和鼠dsNKG2D-IL-15融合蛋白。试图基于2个NKG2D结构域结合肿瘤细胞,IL-15结构域活化NK和CD8+T细胞,从而用于肿瘤的治疗。前期的初步研究已经证实人dsNKG2D-IL-15蛋白具有激活NK细胞的活性；鼠dsNKG2D-IL-15蛋白可结合表达RAE-1阳性的肿瘤细胞,并促进NK细胞活化、增殖以及增强细胞毒功能的活性。本研究拟进一步明确重组dsNKG2D-IL-15蛋白的抗肿瘤效应及其机制,为后续临床实验研究提供必要的实验依据。研究内容分为2部分：1.重组人dsNKG2D-IL-15融合蛋白抗肿瘤的活性及其机制目的：观察重组人dsNKG2D-IL-15蛋白结合到MICA (人NKG2D配体)阳性肿瘤细胞的能力,结合到肿瘤细胞表面的dsNKG2D-IL-15对NK细胞活化、增殖和功能的影响,以及抗裸鼠体内移植瘤生长的影响。方法：首先利用流式细胞仪(FCM)检测重组人dsNKG2D-IL-15融合蛋白结合MICA阳性肿瘤细胞的活性。其次分别用可溶性和固定型dsNKG2D-IL-15融合蛋白分别与人外周血单个核细胞(PBMC)孵育过夜,FCM检测NK细胞表面活化性受体CD69、NKp46、 NKG2D、CXCR3、DNAM-1等受体的表达,胞内染色法检测IFN-γ分泌,MTS／PMS法检测NK细胞的增殖,CD107a脱颗粒法、LDH释放法检测NK细胞的杀伤活性。接着分析dsNKG2D-IL-15融合蛋白结合到K562-MICA细胞后,FCM检测NK细胞表面CD69、NKG2D、CD107a等其他表面受体的表达以及IFN-γ的分泌。另外,给Balb/c裸鼠背部皮下接种胃癌细胞株SGC-7901,成瘤5天后,每天腹腔分别注射人dsNKG2D-IL-15融合蛋白、鼠dsNKG2D-IL-15融合蛋白、磷酸盐缓冲液(PBS),持续21天,每天记录肿瘤生长情况以及小鼠存活情况。治疗21天后处死小鼠,分析荷瘤鼠脾脏和肿瘤组织内NK细胞的频率以及NKG2D+/NK+双阳性细胞的频率。结果：人dsNKG2D-IL-15可与MICA阳性肿瘤细胞结合。可溶性和固定型重组人dsNKG2D-IL-15蛋白均可上调NK细胞表达CD69,增强NK细胞的细胞毒活性,刺激其分泌IFN-γ,促进NK细胞的增殖,CD16表达强度轻度降低,NKp46、CXCR3、NKG2A表达增加,DNAM-1的表达无明显变化。结合至肿瘤细胞表面的人dsNKG2D-IL-15具有增强NK细胞活化、分泌IFN-γ、靶向杀伤肿瘤细胞的功能。裸鼠荷瘤实验显示,与PBS组、鼠dsNKG2D-IL-15治疗组比较,重组人dsNKG2D-IL-15蛋白治疗组肿瘤生长速度缓慢、生存期延长,并且该组小鼠脾脏和肿瘤组织内的NK细胞频率均升高,且NKG2D阳性NK细胞的频率明显增高。结论：重组人dsNKG2D-IL-15融合蛋白同时具有结合MICA阳性肿瘤细胞和刺激NK细胞活化、增殖和细胞毒功能的活性,体内具有抑制MICA阳性肿瘤生长、延长荷瘤小鼠生存期的效应。该抗肿瘤效应主要与dsNKG2D-IL-15体内刺激NK细胞活化及浸润至肿瘤有关。2.重组鼠dsNKG2D-IL-15融合蛋白体内抗肿瘤的活性及其机制目的：观察重组鼠dsNKG2D-IL-15融合蛋白抗Balb/c小鼠体内移植瘤的活性及其机制。方法：首先利用FCM检测重组鼠dsNKG2D-IL-15融合蛋白结合Ba/f3-RAE细胞表面RAE-1分子的活性。其次用LDH释放法检测鼠dsNKG2D-IL-15融合蛋白结合肿瘤细胞后,对NK细胞杀伤肿瘤活性的影响。接着给Balb/c小鼠背部皮下接种结肠癌细胞株CT-26,成瘤当天或5天后腹腔分别注射鼠dsNKG2D-IL-15融合蛋白、人dsNKg2D-IL-15融合蛋白、PBS,持续21天,每天记录肿瘤组织的生长情况和小鼠的存活情况。治疗21天后处死小鼠,分析荷瘤鼠脾脏和肿瘤组织内NK、CD8+T细胞的频率以及NKG2D+/NK. CD8+/NKG2D+T双阳性细胞的频率。结果：重组鼠dsNKG2D-IL-15融合蛋白具有RAE-1阳性肿瘤细胞的活性,该蛋白结合至RAE阳性肿瘤细胞后,显著增强NK细胞靶向杀伤RAE-1阳性肿瘤细胞的活性。Balb/c小鼠结肠癌移植瘤实验显示,与对照组及人dsNKG2D-IL-15治疗组相比,鼠dsNKG2D-IL-15蛋白治疗组肿瘤生长速度减慢,荷瘤小鼠的存活期延长,且鼠dsNKG2D-IL-15蛋白治疗组小鼠的脾脏和肿瘤组织内NK、CD8+T细胞频率均上调,同时NK、CD8+T细胞表面NKG2D的表达也上调。结论：重组鼠dsNKG2D-IL-15融合蛋白既结合RAE-1阳性肿瘤细胞,又增强NK细胞靶向杀伤RAE-1阳性肿瘤细胞活性。体内具有显著抑制RAE-1阳性肿瘤生长、延长荷瘤小鼠生存期的效应。该抗肿瘤效应主要与鼠dsNKG2D-IL-15蛋白刺激NK和CD8+T细胞活化及浸润至肿瘤有关。