目的动脉粥样硬化相关的心血管疾病是全球死亡率的主要病因。脂质功能失调、动脉脂质聚集、免疫-炎症应答是动脉粥样硬化发生发展的主要原因[1,2]。巨噬细胞炎症在动脉粥样硬化发展的各个阶段都发挥重要作用,包括从动脉粥样硬化始发到斑块破裂,从而引发血栓形成的级联效应[3]。因此寻找到一种巨噬细胞炎症的调节因子可能成为动脉粥样硬化治疗的新途径。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)是一种可对抗腺病毒E1A癌蛋白诱导的转录激活和细胞转化的分泌型糖蛋白[4]。我们前期研究工作发现,在兔和人动脉粥样硬化血管中CREG蛋白表达水平均较正常血管降低,并且在兔动脉粥样硬化病变进展过程中,CREG表达下调具有时间依赖性。这些结果提示CREG可能参与了动脉粥样硬化进程。本实验室研究发现,CREG具有抗炎的潜在作用[5]。从NCBI-UniGene网站的est数据库检索人和小鼠组织cregmrna资料,发现两个物种都是在淋巴结中creg表达量最高。淋巴结是富含巨噬细胞的组织,因此我们推断creg可能对抗巨噬细胞炎症,其在动脉粥样硬化发病中具有重要作用。本研究拟明确creg是否参与并可抑制肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-alpha,tnf-α)诱导的巨噬细胞炎症并揭示其可能机制,并评估creg对动脉粥样硬化病变是否有干预作用。材料和方法raw264.7小鼠巨噬细胞转染cregsirna以建立creg表达下调细胞模型。westernblot检测creg,cathepsinb,cathepsinl,溶酶体相关膜蛋白1(lysosome-associatedmembraneprotein1,lamp1),6-磷酸甘露糖/胰岛素样生长因子ii受体(themannose6-phosphate/insulin-likegrowthfactoriireceptor,m6p/igfiir),lc3,beclin1,p62和tubulin表达水平。image-proplus软件用于免疫印迹定量。小鼠il-6和mcp-1elisa试剂盒检测il-6和mcp-1细胞上清分泌量和组织裂解产物中蛋白表达量。免疫荧光双染色后共聚焦显微镜观察his蛋白和cathepsinb/cathepsinl/m6p/igfiir/lamp1的共定位。lysotrackerred染色观察溶酶体。电镜观察creg表达上调和下调细胞中自噬体和自噬溶酶体形成。免疫共沉淀检测外源性重组creg蛋白和cathepsinb、cathepsinl、igfiir的相互作用。实验入选40只10周龄,体重20–25g的雄性apoe-/-小鼠,饲以含21%脂肪、1.3%胆固醇的高脂、高胆固醇饮食16周。在高脂喂养4-12周时,对照组施以假手术,实验组用微量渗透泵以30μg/kg/d皮下给予重组creg蛋白缓释治疗。收集小鼠主动脉油红o染色及苏木素伊红(hemotoxylin-esion,he)染色观察动脉粥样硬化斑块。免疫组织化学染色观察动脉粥样硬化斑块中cd68和mcp-1表达。结果1.creg表达与tnf-α诱导的raw264.7小鼠单核巨噬细胞炎症反应有相关关系tnf-α是一种具有促炎作用的多效性细胞因子。首先,为研究探讨tnf-α刺激后,raw264.7细胞炎症因子分泌情况,我们在raw264.7细胞培养基中加入20ng/mltnf-α分别刺激0,30min,2h,6h,12h,16h和24h,收集细胞上清,elisa检测细胞上清il-6和mcp-1分泌量。结果发现,il-6和mcp-1分泌量对tnf-α刺激具有时间依赖性。同时在tnf-α刺激过程中,raw264.7细胞中creg表达先短暂升高,继而呈时间依赖性降低。creg表达变化与tnf-α诱导的raw264.7细胞炎症反应具有相关性,提示creg可能在tnf-α诱导的炎症中发挥重要作用。2.creg表达变化干预tnf-α诱导的raw264.7细胞炎症反应为探讨creg对tnf-α诱导的raw264.7细胞炎症反应的作用,我们应用了gain-of-function和loss-of-function模型,通过检测tnf-α刺激后细胞上清il-6及mcp-1分泌变化,观察creg在raw264.7细胞炎症反应中的作用。当在tnf-α刺激的raw264.7细胞中添加不同浓度(0,0.5μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml)的外源性重组creg蛋白24h后,westernblot检测外源重组creg蛋白的表达量呈现逐渐升高趋势。westernblot检测证实cregsirna转染raw264.7细胞并用tnf-α刺激后,creg表达量较对照组降低82.7%(p<0.001)。elisa结果发现,重组creg蛋白表达呈剂量依赖性抑制tnf-α刺激后raw264.7细胞中il-6和mcp-1分泌。相反,在转染cregsirna下调creg表达变化后,raw264.7细胞中il-6和mcp-1分泌量较对照组增加。上述结果提示,creg表达上调可减轻炎症反应,而creg表达下调则可以促进炎症因子分泌。因此,creg可对抗tnf-α诱导的raw264.7细胞炎症反应。3.creg促进raw264.7细胞自噬从而减轻tnf-α诱导的炎症反应已有研究报道证实,自噬是细胞对抗炎症损伤的重要防御机制之一[6,7]。因此,自噬也可能在巨噬细胞炎症中发挥重要作用。为研究creg对自噬的影响,我们应用gain-of-function和loss-of-function模型,用电镜观察creg表达上调和creg表达下调的raw264.7细胞中自噬体和自噬溶酶体发生情况,以获得自噬激活的直接证据。结果发现,对照组tnf-α刺激后raw264.7细胞中可见自噬泡和自噬体,添加外源性creg蛋白后细胞中自噬溶酶体数量明显增加,而在转染sirna下调creg表达的细胞中则仅见到少量自噬体。同时,westernblot检测证实,外源性creg蛋白可诱导自噬,表现为自噬体结合蛋白lc3ii表达增加,beclin1增加,p62降低。p62是一种将泛素结合物转运至自噬体并在自噬过程中消耗的蛋白。在creg表达下调细胞中,lc3ii和beclin1表达量增加,自噬降解的底物蛋白p62也增加,提示自噬体堆积,自噬功能受损。为研究自噬在creg抗炎中的作用,我们应用了自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-ma)和bafilomycina对抗细胞自噬激活,观察tnf-α诱导的raw264.7细胞炎症反应情况。添加自噬抑制剂3-ma和bafilomycina后可对抗creg蛋白的炎症抑制作用。这些结果提示自噬在tnf-α诱导的raw264.7细胞炎症中发挥重要作用,creg可通过促进自噬抑制tnf-α诱导的细胞炎症反应。4.creg蛋白表达变化影响raw264.7细胞中溶酶体发生和cathepsinb、cathepsinl的成熟creg是一种定位于溶酶体的分泌型糖蛋白[8],为进一步验证creg对溶酶体的作用,我们应用gain-of-function和loss-of-function模型,观察creg对cathepsinb、cathepsinl和lamp1表达的影响。免疫荧光染色结果发现,在添加外源性creg蛋白(20μg/ml)后,与对照组相比,raw264.7细胞中cathepsinb和cathepsinl荧光强度明显增加;而在转染cregsirna下调creg表达变化后,raw264.7细胞中cathepsinb和cathepsinl荧光强度明显降低,表达量明显减少。westernblot检测creg表达变化对cathepsinb和cathepsinl的影响,其趋势与免疫荧光染色结果相似。在添加外源性creg蛋白后,与对照组相比,raw264.7细胞中cathepsinb、cathepsinl和lamp1表达增加;而在转染cregsirna下调creg表达变化后,raw264.7细胞中cathepsinb、cathepsinl和lamp1表达明显降低。同时研究发现,外源性添加creg蛋白后cathepsinb(25kda)和cathepsinl(25kda)的成熟体增多,成熟体与酶前体比例(25kda/40kda,25kda/42kda)增加(p<0.05,p<0.01);而在creg表达下调组,cathepsinb(25kda)和cathepsinl(25kda)的成熟体减少,成熟体与酶前体比例(25kda/40kda,25kda/42kda)降低(p<0.05,p<0.05)。以上结果提示,creg表达上调可促进raw264.7细胞中成熟形式的cathepsinb和cathepsinl表达,并促进lamp1表达,而creg表达下调则抑制cathepsinb和cathepsinl成熟,并抑制lamp1表达。lysotrackerred是一种进行了荧光标记的带有弱碱性的红色荧光探针,可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中,从而实现对活细胞溶酶体的特异性荧光标记,可用来评估溶酶体数量[9]。在添加外源性creg蛋白后,与对照组相比,raw264.7细胞中lysotracker红色荧光强度明显增加;而在转染cregsirna下调creg表达变化后,lysotracker红色荧光强度明显降低。上述结果提示,creg蛋白表达变化影响raw264.7细胞中溶酶体发生和cathepsinb、cathepsinl的成熟。由于溶酶体活性对自噬至关重要[10],我们推断creg可能通过其对溶酶体的影响调节自噬过程。5.外源性creg重组蛋白定位于溶酶体并通过m6p/igfiir与溶酶体相互作用,且影响m6p/igfiir的细胞内分布以往研究证实,creg是一种与m6p/igfiir直接结合的溶酶体蛋白,并依赖于与m6p受体的相互作用有效转运至溶酶体[8]。外源性添加creg蛋白是否与内源性creg蛋白具有相同特性并能与m6p/igfiir相互作用尚不清楚。外源性creg蛋白是带有his标签并通过与ni-nta柱结合纯化的蛋白。为研究外源性creg蛋白与溶酶体的定位关系,分别以抗his抗体与抗cathepsinb、抗cathepsinl、抗lamp1、抗igfiir抗体,对添加了带有his标签的外源性creg蛋白的raw264.7细胞行免疫荧光双染,发现均有明确的共定位关系。免疫共沉淀提示带有his标签的creg蛋白与溶酶体组织蛋白酶cathepsinb、cathepsinl和m6p/igfiir有直接相互作用关系。westernblot检测creg表达上调和表达下调后,raw264.7细胞中m6p/igfiir表达量与对照组相比无统计学差异。免疫荧光染色结果发现,在添加外源性creg蛋白后,igfiir标记的红色荧光广泛分布于细胞质和细胞膜上,并与溶酶体结构蛋白lamp1有共定位关系;而在creg表达下调的raw264.7细胞中,igfiir标记的红色荧光主要分布于细胞核周围,且与lamp1仅有部分共定位关系。以上结果提示,外源性creg蛋白导入细胞后,与内源性creg蛋白具有同样的溶酶体定位。creg对m6p/igfiir表达变化无影响,而影响其在细胞内的定位,m6p/igfiir对溶酶体的结合及转运有重要作用,因此,creg可能通过调节m6p/igfiir的细胞内定位而影响溶酶体酶的表达变化和溶酶体发生,进而影响了细胞自噬和炎症反应的发生。6.creg重组蛋白干预可减轻高脂喂养的apoe-/-小鼠动脉粥样硬化程度并影响主动脉炎症及自噬为研究creg蛋白对动脉粥样硬化病变的影响,apoe-/-小鼠饲以含21%脂肪、1.3%胆固醇的高脂、高胆固醇饲料16周。高脂喂养的4-12周,对照组施行假性手术,干预组于小鼠背部皮下埋置渗透性微量泵泵入CREG蛋白。主动脉油红O染色显示,CREG蛋白埋泵干预组小鼠主动脉腔内动脉粥样硬化斑块面积较对照组明显减小。HE染色可观察到同样结果。ELISA检测CREG蛋白埋泵干预组小鼠主动脉组织匀浆中MCP-1表达量较对照组降低。免疫组织化学染色显示CREG蛋白埋泵干预组主动脉根部粥样硬化斑块中小鼠巨噬细胞标志物CD68和MCP-1阳性区域占斑块面积百分比低于对照组。Western blot结果显示,外源性CREG蛋白可诱导高脂喂养ApoE-/-小鼠的自噬反应,表现为主动脉组织蛋白中自噬体结合蛋白LC3 II表达增加,p62降低。以上结果证实,外源性CREG蛋白干预可减轻高脂喂养的ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化病变程度,抑制炎症反应、促进自噬,CREG可能通过上述机制发挥其抗动脉粥样硬化的治疗作用。结论CREG可以通过影响M6P/IGFIIR细胞内分布而影响溶酶体发生,从而促进巨噬细胞自噬,抑制炎症。CREG可能在未来动脉粥样硬化治疗中具有前景。