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高血压是最常见的心血管疾病之一,直接影响和损害人身体健康。血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE,EC 3.4.15.1)在调节血压和控制心血管疾病中起重要作用。ACE有两个活性结构域,其中C-结构域是血压调控的主要作用位点,而N-结构域对血压调节没有显著效果。生物活性小肽类ACE抑制肽因其毒副作用小,易吸收而受到广泛关注。因此,明确ACE两个结构域与生物活性小肽的作用机理,进而有效抑制ACE十分必要。本文以含酪氨酸残基的ACE抑制二肽为研究对象。对其ACE结构域选择性抑制活性、稳定性、与ACE相互作用方面进行研究。主要研究内容及结果如下:(1)筛选对ACE的C-结构域具有选择性抑制作用的含酪氨酸二肽。结果表明:C端为酪氨酸,N端为酸性、碱性、芳香族、羟基类氨基酸的二肽,对ACE的C结构域为非选择性抑制;N端为脂肪族类氨基酸的二肽对ACE C-结构域的抑制活性显著高于其对ACE N-结构域的抑制活性。考察ACE抑制肽末端含酪氨酸残基对ACE结构域抑制活性的影响。结果表明:N端为酪氨酸残基的二肽Tyr-Ala(YA)、Tyr-Leu(YL)、Tyr-Ile(YI)对ACE的C-结构域和N-结构域抑制活性无显著差异。而C端为酪氨酸残基的二肽AY、LY、IY对ACE的C-结构域选择性抑制效果显著。ACE抑制剂C端为酪氨酸残基的结构对于抑制ACE的C结构域是一个有利结构。通过高效液相色谱对C端含酪氨酸残基的二肽Ser-Tyr(SY)、Ala-Tyr(AY)、Leu-Tyr(LY)、Arg-Tyr(RY)、Ile-Tyr(IY)、Phe-Tyr(FY)、Glu-Tyr(EY)、Val-Tyr(VY)抑制类型进行测定。结果表明:N端为脂肪族氨基酸的含酪氨酸二肽IY和LY为竞争性抑制、AY和VY为混合型抑制,N端为酸性、碱性、芳香族、羟基氨基酸时则为非竞争性抑制。(2)测定含酪氨酸残基ACE抑制二肽AY、IY、LY、SY的热稳定性、抗消化性能,优化了AY、IY、LY、SY的定量检测分析方法。结果表明:AY、IY、LY、SY含量在0.01~2 mg/mL的浓度范围内均具有良好的线性关系,回收率在98.41%~100.29%,准确度及精密度的RSD均小于1%,其检出限为2-3μg/mL。该检测方法可准确定量样品中AY、IY、LY、SY的含量,方便快捷,且准确性高。在37℃、50℃、70℃条件下6 h内IY、LY、AY、SY均有较好的热稳定性,其中IY稳定性较好。AY、IY、LY、SY具有较好的抗胃蛋白酶消化能力,人工胃液反应2 h后,肽损失率均小于10.00%。AY、IY、LY、SY具有好的抗胰蛋白酶消化能力,肽损失率范围在12.73%~16.01%,SY的抗消化能力相对低于IY、LY、AY。含酪氨酸残基ACE抑制二肽AY、IY、LY、SY具有较好的热稳定性和良好的抗胃肠道消化能力。(3)通过核磁共振技术,研究具有ACE C-结构域选择性抑制作用的IY、非结构域选择性抑制作用的SY在水、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇三种溶剂中的构象变化。两者在水溶液中均以柔顺自由伸展的构象存在,在甲醇溶液中是以伸展状态为优势构象并伴有折叠构象存在,在DMSO溶液则处于折叠蜷缩的状态。通过圆二色光谱、紫外可见光谱、红外光谱技术手段,研究AY、IY、SY、LY与ACE相互作用后ACE的构象变化。四种二肽均使ACE构象发生改变,主要使ACE的α-螺旋、β-折叠发生改变;具有C-结构域选择性抑制作用、竞争性抑制的IY对ACE的构象改变最为显著。通过分子模拟手段对含酪氨酸残基的ACE抑制二肽与ACE结构域相互作用进行研究。AY、IY、LY对ACE C-结构域具有好的亲和力,其中IY、LY对ACE C-结构域有较高的亲和力。二肽的N端氨基酸,在与ACE C-结构域结合中相比其与ACE N-结构域结合中作用更大。本文研究结果可为含酪氨酸残基二肽ACE选择性抑制机理提供理论基础。为研究含酪氨酸的ACE抑制肽的生物口服利用度、针对性设计ACE C-结构域选择性抑制肽提供理论依据。