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庚型肝炎病毒（hepatitis G virus,HGV）是新发现的经输血传播的单正链RNA病毒。HGV与黄病毒科的其它成员，尤其是丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV），具有相似的基因组结构。HGV的开放读码框架（open reading frame,ORF）编码一个约2900个氨基酸的蛋白前体，与HCV的蛋白前体在氨基酸水平有25.5％的同源性。HGV除了核心蛋白存在与否仍有争议外，其前体蛋白在结构上与HCV的C-E1-E2-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B结构非常相似。然而，HGV和HCV在生物学特点上却差别显著。本研究利用已建立的HGV转基因Founder小鼠进行传代培育，获得了能稳定传代并较高表达的转基因小鼠品系，提供了一个可在分子水平、细胞水平和整体水平研究HGV的有效体系。以该转基因鼠为技术平台，本文亦在HGV体内外复制与表达、HGV致病性、HGV与HCV复制和表达差异及疫苗评价等方面进行了系列探讨。 一 全长HGV转基因小鼠的遗传育种与特性研究 转基因小鼠是病毒研究的有效体系，利用本室克隆出的完整HGV cDNA克隆(HGVqz)构建由CMV启动子调控的含HGV全长基因的目的片段，用显微注射法建立了整合有HGV全长基因的Founder小鼠。本研究利用已建立的4株（#2、#4、#8、#9）Founder小鼠分别和同系正常异性小鼠交配的方式进行转基因小鼠传代培育及建系。所产仔鼠经PCR和Southern blot进行筛选并以ELISA检测小鼠血清HGV抗原含量，免疫组织化学法检测小鼠组织HGV抗原表达。表达量较高的阳性小鼠被用于进一步传代、保种。目前，#2号Founder小鼠已传至F5代并从中筛选出了表达量相对较高的小鼠品系，#8号Founder小鼠已传至F3代，但#4、#9号Founder小鼠在传代过程中整合的外源基因丢失。对#2号Founder小鼠F1-F5代HGV NS3基因的分析表明，至少在有效的测序范围内，未发现核苷酸的突变或缺失。 转基因小鼠各组织RT-PCR检测表明：HGV RNA可以在多个组织检测到，而且肝、肾、肺等若干组织还有复制中间体负链RNA的存在。转基因小鼠若干组织的免疫组化实验表明：HGV可以在转基因小鼠肝、肾、肺等多个组织表达，各个组织的表达强度不一致，以肝脏表达最强，但HGV抗原在肝细胞中的分布并不均匀。ELISA结果表明转基因小鼠体内不存在HGV抗体，但HGV抗原可以分泌至血清中，其中从#2号Founder小鼠后代筛选到血清HGV抗原含量相对较高且传代后仍较稳定的转基因小鼠。#8号Founder小鼠后代亦有血清HGV抗原含量相对较高的转基因小鼠，虽然成年鼠不同年龄段血清HGV抗原含量相对比较稳定，但经传代后血清HGV抗原大大降低甚至消失。常规病理学切片观察显示：转基因小鼠基本不发生明显的病理学变化，只有肝脏有淋巴细胞浸润等轻度的炎性变，其他组织均未见异常。血清酶学分析显示，转基因小鼠与正常小鼠血清转氨酶水平无明显差异。第二军医大学博士论文二鼠伤寒沙门氏菌pagc启动子的克隆与活性分析 从鼠伤寒沙门菌中克隆出pagC启动子（P pagC），构建体内激活的表达质粒pZW，插入庚型肝炎病毒（HGV）Ns3基因，构建出表达质粒pZWNS3。以其转化减毒鼠伤寒沙门菌sL72o7，观察Ppagc的启动活性。结果表明:Mg2+可抑制Ppagc的启动活性，Mg2+浓度<5 Olnmol几时培养的重组菌经sDs一PAGE和westem blot检测能高水平表达HGv Ns3蛋白。Mg2+浓度升至50。l几时，Ns3蛋白表达量明显降低。收集以50ol几Mg2+的培养基扩增的重组菌，灌胃接种c57小鼠，检坝ll/j、鼠的血清抗体、T细胞增殖和CTL反应。结果显示PpagC是一个强的宿主体内激活的启动子，为构建以伤寒沙门菌为载体的高效免疫口服疫苗提供了一个新的途径。三含体内激活启动子的重组减毒鼠伤寒沙门菌能诱导转基因鼠细胞免疫应答 本研究以庚型肝炎病毒（hePatitis G virus，HGV）转基因小鼠为模型，探讨逆转免疫耐受的方法及与HGV致病性的关系。首先采用鼠伤寒沙门菌pagC基因的启动子（PpagC）为转录调控元件，构建宿主体内表达HGV NS3抗原的重组减毒鼠伤寒沙门菌，口服接种免疫HGV转基因小鼠。结果证明对诱导转基因小鼠血清HGv Ns3抗体无明显影响，但对小鼠血清HGv抗原含量、肝组织HGv抗原及HGV mRNA表达量有明显抑制作用。体外培养脾细胞表现出针对HGVNS3抗原的细胞免疫反应，并检测到Thl型细胞因子IFN一Y。过继转移实验证明T细胞可能是通过IFN一Y介导的机制抑制转基因鼠体内HGV的表达及复制。组织病理学检查显示，转基因小鼠肝组织见淋巴细胞浸润等轻度炎性变。T细胞免疫耐受消除的结果提示，这种宿主体内激活目的抗原表达的口服疫苗有望成为治疗病毒性肝炎的新方法。四Hcv la/lb型嵌合体能在H印GZ细胞内复制与表达 为研究丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）la和lb型嵌合体全长eDNA在HePGZ细胞中的复制和表达。以HCVI创lb嵌合体cDNA构建表达质粒转染HePGZ细胞，免疫组化和Westem blotting检测HCV蛋白表达，RT一PCR检测HCv正、负链RNA。结果，转染细胞中检测到分子量约70KD的HCV NS3蛋白，转染细胞连续传20代，仍能检测到HCv正、负链RNA。证明该HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达，HCvlb型的RNA依赖的RNA聚