[背景与目的]肝纤维化(HF)是指肝脏对各种慢性损伤的一种修复性应答,是慢性肝病的共同病理改变。肝纤维化的主要病理改变是细胞外基质(ECM)成分的过度合成与异常沉积。在肝纤维化的整个发生发展过程中有多种细胞多种因素的参与,目前普遍认为肝星状细胞(HSC)的活化增殖是肝纤维化形成的中心环节。HSC活化后,其黏附和定向迁移的能力加强,如肝纤维化进程中就发现HSC会定向迁移至损伤部位,导致炎症区域活化的HSC数目增多。肝纤维化极易发展为肝硬化,一旦发展成肝硬化就不可逆转,因此,在肝纤维化阶段采用药物干预有助于疾病的逆转。目前的一些抗肝纤维化药物并不理想,如秋水仙碱、青霉胺等,这些药物毒副作用大,在临床上不易推广。这就使研究者们开始把目光转向了效果较为温和的中药以及一些功能性食品上,如大蒜。国内外多项研究显示,大蒜的主要功效成分—大蒜有机硫化物对正常肝脏和化学毒物引起的氧化性肝损伤能起到一定的保护作用,而这一作用主要是通过增强肝脏谷胱甘肽抗氧化系统功能和通过调节肝脏药物代谢酶增强肝脏解毒系统功能实现的。其中,抗氧化活性起了重要的作用。这一系列研究都从理论上奠定了二烯丙基三硫醚(DATS)抗肝纤维化基础,但目前国内外未有涉及此方面的报道,因此我选择DATS作为大蒜有机硫化物的代表物质来研究其抗肝纤维化作用及其具体的作用机制。[研究方法]本研究主要分为体内体外两大部分。1)体内研究部分：本研究采用四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝纤维化模型,DATS不同浓度(50、100、200mg/kg)及阳性药物秋水仙碱(0.1mg/kg)干预处理,末次给药24h后,取血清检测ALT、AST、TP、ALB;HE染色和天狼猩红染色检测肝组织病理切片；免疫荧光、RT-PCR及Western blot检测肝组织中α-SMA、αI(I)Procollagen.FN等与HSC活化有关的指标;同时利用试剂盒检测氧化指标LPO、MDA及GSH以考查DATS抗氧化的能力。2)体外研究部分：以HSC为体外研究对象,MTT法和LDH法考查不同浓度DATS对HSC的毒性,以选择对HSC没有毒性的DATS浓度作为接下来的用药浓度；接下来又通过MTT法对H202的浓度进行摸索,以筛选出能促进HSC增殖的最佳H202浓度,建立体外氧化应激诱导HSC增殖活化模型。在摸索好DATS及刺激因子H202的浓度后,MTT法、Western blot及Real-time RCR考查DATS对氧化应激诱导的HSC增殖活化的影响,并通过流式细胞仪、Western blot, Hoechst33258染色考查DATS对HSC周期及凋亡的影响；划痕实验和Transwell小室实验考查DATS对HSC运动和迁移能力的影响；另外,同体内研究一样,利用试剂盒对与氧化应激相关的指标如ROS、LPO及GSH进行检测。3)基于一系列理论基础,我们又进一步提出假说：DATS可能是通过释放H2S来发挥功效的。为验证这一假说,我们采用抑制剂碘乙酰胺抑制H2S的生成,再利用相关实验手段考查DATS的功效是否受到影响。[研究结果]1、肉眼观察肝脏,发现模型组肝脏颜色变黄,质地变硬,表面粗糙,且出现很多颗粒状物质;HE染色结果显示,模型组SD大鼠肝脏中发生了大范围的脂肪变性,胶原纤维增生显著；血清生化指标结果显示,模型组SD大鼠AST, ALT显著升高(P<0.01；P<0.001)；低(50mg/kg)、中(100mg/kg)、高剂量(200mg/kg)组DATS明显地降低血清中AST、ALT水平,并表现出剂量依赖性；但不同组别中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)并无明显改变；HE染色显示,DATS对肝脏病理结构呈现明显的改善作用,其中以高剂量组DATS (200mg/kg)的作用最为明显,提示DATS对CCl4引起的肝损伤有显著的保护作用。同样,血清指标检测结果也支持了以上结论。2、天狼猩红染色、αI(I)Procollagen免疫荧光染色及羟脯氨酸(Hyp)含量检测显示,CCl4诱导肝脏出现大量胶原纤维的沉积,而DATS显著地抑制胶原纤维的产生；免疫荧光染色、RT-PCR及Western blot显示,不同剂量的DATS剂量依赖性地抑制CCl4诱导的与HSC活化有关的指标如α-SMA、αI(I)Procollagen, FN等的升高,表明DATS抑制HSC的活化,保护肝纤维化。3、DATS剂量依赖性地降低氧化指标LPO, MDA的升高,并提高肝组织中还原型GSH的水平,提示DATS具有明显的抗氧化作用。4、体外研究显示DATS剂量依赖性地抑制氧化应激诱导的HSC的增殖和活化；流式细胞仪分析、Hoechst33258染色及Western blot检测显示,DATS使HSC阻滞在G2/M期,并能诱导HSC发生凋亡；划痕实验及Transwell小室实验结果显示DATS抑制由氧化应激诱导的HSC迁移能力的提高；此外,同体内结果一致,DATS抑制氧化应激引起的氧化指标ROS和LPO的升高,并提高抗氧化剂GSH水平,表现出显著的抗氧化能力。5、采用碘乙酰胺后,DATS对HSC的一系列功效得到了逆转。初步表明DATS可能是通过释放H2S来发挥抗肝纤维化作用的。[结论和意义]体内研究显示DATS具有显著的抗肝纤维化作用；体外研究显示,DATS的这一作用主要与其抑制氧化应激诱导的HSC活化及其抗氧化能力有关。进一步的研究又表明DATS可能是通过释放H2S来发挥以上功效的。我们的研究为DATS治疗肝纤维化的作用及作用机制提供了一个新的视角。DATS有望成为临床防治肝纤维化的理想药物。