【摘 要】
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有机磷农药因环境污染和食药残留问题严重威胁着人们的身心健康,这使有机磷农药降解酶的研发迫在眉睫。降解有机磷农药的主要酶类是磷酸三酯酶,因其成本低、快速解毒而引起人
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有机磷农药因环境污染和食药残留问题严重威胁着人们的身心健康,这使有机磷农药降解酶的研发迫在眉睫。降解有机磷农药的主要酶类是磷酸三酯酶,因其成本低、快速解毒而引起人们的广泛关注,而来源于嗜热菌中的酶类以其稳定性好、活力高而备受青睐。本试验从嗜热菌Thermaerobacter subterranean BAA137中调取磷酸三酯酶基因(PTE),构建重组质粒pET-28a-PTE,经转化诱导在大肠杆菌BL21中高效表达。通过组氨酸镍柱分离纯化、SDS-PAGE和Western-blot鉴定,得到目标蛋白,并进行酶学性质表征。(1)对嗜热菌Thermaerobacter subterranean BAA137进行复壮培养,结果表明:2%接种量、60℃静置培养24h为嗜热菌最适生长条件,这极大缩短了嗜热菌的生长周期。(2)以嗜热菌TS基因为模板,PCR扩增出磷酸三酯酶基因,构建重组质粒pET-28a(+),测序结果表明磷酸三酯酶基因克隆成功。(3)对重组酶进行性质表征,结果显示:重组磷酸三酯酶是别构酶,Vmax为101.81U/mg,Hill系数n为0.8,显示负协同效应;其最适温度是70℃,最适pH是8,半衰期是4h;金属离子对重组磷酸三酯酶的影响中,Ba2+、Ni2+和Mg2+随着离子浓度的增加酶活力随之降低,显示出明显的抑制作用。其中Co2+和Zn2+的激活作用最明显;大多数有机溶剂对重组磷酸三酯酶有激活作用(除丙三醇外),并且随着浓度的增加,酶活力也增高,其中二甲基亚砜的作用最明显。
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