目的:G-四链体结构是DNA或RNA形成的高级结构,该结构的稳定存在对基因组转录和表达以及基因组的稳定性有重要的作用,目前端粒G-四链体结构是治疗癌症的一个重要方向。本论文建立细胞内G-四链体结构检测的新方法,并利用该方法研究TMPyP4诱导G-四链体形成导致Hela细胞衰老机制,为G-四链体稳定剂抑癌作用的研究奠定理论基础。方法:(1)通过自诱导培养基诱导pSANG10-BG4质粒表达BG4抗体并纯化,采用考马斯亮蓝染色和Western Blot的方法鉴定BG4抗体相对分子量大小;然后采用BG4抗体的免疫荧光技术确定BG4抗体在细胞内的活性,并建立细胞内G-四链体结构检测的新方法。(2)TMPyP4处理Hela细胞24 h,采用荧光原位杂交和BG4抗体的免疫荧光技术对Hela细胞的基因组G-四链体结构和端粒G-四链体进行检测;然后再利用双重免疫荧光技术对Hela细胞的基因组DNA损伤和基因组G-四链体DNA损伤进行检测;最后通过荧光原位杂交和免疫荧光技术对Hela细胞的基因组DNA损伤和端粒DNA损伤进行检测。(3)TMPyP4处理Hela细胞24 h,秋水仙素处理2 h,然后制备中期染色体,采用荧光原位杂交技术检测Hela细胞端粒功能紊乱的情况;采用SA-β-半乳糖苷酶染色检测TMPyP4处理24 h的Hela细胞衰老情况。结果:(1)采用自诱导培养基表达纯化BG4抗体,经考马斯亮蓝染色和Western Blot检测,结果显示其相对分子量大小为30~40 kD;经过自诱导培养基的诱导,BG4抗体的条带明显增加,由此证实该方法表达纯化BG4抗体确实可行。利用免疫荧光的方法检测纯化出的BG4抗体在细胞内的活性,经RNase处理后,发现几乎所有的红色荧光信号都存在于细胞核中,证实在检测基因组G-四连体结构时不存在RNA的干扰;而经DNase处理后,几乎所有的红色荧光信号存在于细胞质中。通过上述实验证实了BG4抗体被成功表达纯化,同时证明BG4抗体在细胞内具有活性的,成功建立细胞内G-四链体结构检测的新方法。(2)Hela细胞经过TMPyP4处理24 h,采用荧光原位杂交和免疫荧光技术检测Hela细胞基因组G-四链体结构和端粒G-四链体结构信号,结果发现细胞内基因组G-四链体和端粒G-四链体结构明显增加;再用双重免疫荧光技术检测TMPyP4处理24 h的Hela细胞的G-四链体结构信号和DNA损伤信号,结果表明细胞内基因组DNA损伤和基因组G-四链体DNA损伤均增加;最后利用荧光原位杂交和免疫荧光技术检测TMPyP4处理24 h的Hela细胞的端粒信号和DNA损伤信号,结果发现细胞内基因组DNA损伤和端粒DNA损伤明显增加。上述实验结果表明TMPyP4诱导G-四链体结构稳定形成后使Hela细胞的基因组DNA损伤和端粒DNA损伤明显增加。(3)利用荧光原位杂交技术检测Hela细胞中期染色体的端粒功能紊乱的情况,结果发现Hela细胞经TMPyP4处理24 h后,染色体形态完整,未出现染色体的断裂,但是染色体末端端粒信号随TMPyP4浓度的增加而增加,造成端粒功能紊乱。然后用SA-β-半乳糖苷酶染色检测TMPyP4处理24 h的Hela细胞衰老情况,证实Hela细胞经TMPyP4处理24 h后衰老的细胞明显增加。结论:纯化表达的BG4抗体成功用于G-四链体结构的检测,并成功建立细胞内G-四链体结构检测的新方法,并用该方法研究G-四链体造成细胞衰老的机制。经G-四链体稳定剂—TMPyP4处理Hela细胞后,基因组G-四链体结构、端粒G-四链体结构的数量增加;同时TMPyP4诱导G-四链体结构稳定形成后使Hela细胞的基因组DNA损伤和端粒DNA损伤明显增加,也会使细胞衰老的数量和端粒功能紊乱的情况增加。上述研究结果表明TMPyP4可以造成癌细胞衰老,所以G-四链体稳定剂在治疗肿瘤的领域可能有广阔的应用前景。