研究背景microRNAs（miRNAs）是一类长度约18-24个核苷酸的非编码小RNA分子,主要参与基因转录后水平的调控,是肿瘤发生、组织稳态和再生等重要生物学过程中不可或缺的调节因子。其中,miR-101是近年来发现的一个十分重要的miRNAs家族成员,被认为在多种类型的恶性肿瘤中扮演着抑癌miRNA的角色。以往研究表明,miR-101的异常表达与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关,且其下游靶点十分复杂。虽然关于miR-101靶向抑制下游基因发挥抑癌作用的研究已有不少,但关于其在肝癌中的作用机制还不够完善和深入。因此,我们课题组将研究重点放在了miR-101在肝癌中的靶向抑癌机制。课题组前期的研究发现,在肝癌细胞中,c-Myc会与EZH2蛋白结合募集以EZH2为核心的PRC2复合物导致miR-101的表观遗传学沉默,miR-101还能负向调控PRC2复合物中的两个组分——EZH2和EED,从而在miR-101与PRC2之间形成一个双负反馈环路,该环路的失衡会导致miR-101的进一步沉默以及下游信号通路的异常活化,通过调控多个靶基因影响肝癌的恶性表型。在筛选下游基因的过程中,我们还发现了一个十分重要的分子——中心体蛋白55（centrosomal protein,55 k D,CEP55）,它在肝癌中的作用研究较少,其与miR-101之间的靶向关系研究还未曾报道。研究目的寻找并验证miR-101新的作用靶点,丰富其在肝癌中的抑癌作用机制。研究方法1.基于ENCORI和Kaplan-Meier Plotter信息平台,对TCGA数据库中关于miR-101的临床相关数据进行分析,同时在体外检测miR-101对肝癌细胞周期分布、凋亡水平以及迁移能力的影响;2.利用生物信息学分析预测miR-101的可能下游靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验、实时定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-q PCR）和蛋白印迹实验（Western blot）进行进一步验证;3.构建稳定CEP55干涉的慢病毒细胞株或设计针对CEP55的特异siRNA,通过细胞集落形成实验、CCK-8细胞增殖实验、细胞流式技术和细胞有丝分裂进展的延时成像,分析CEP55对肝癌细胞体外生长的影响;通过裸鼠皮下荷瘤模型,在体内分析CEP55对肝癌细胞生长的影响;4.构建miR-101和CEP55过表达的肝癌稳转细胞系,分别在体内和体外实验中,通过功能恢复实验分析miR-101是否通过CEP55调控肿瘤细胞生长;5.在肝癌临床样本和肝癌细胞系中验证miR-101与CEP55表达水平的相关性;6.利用ANXA2、ACLY或DDX3X稳定干涉或过表达的慢病毒细胞株,通过功能缺失、过表达和挽救实验,分析这3个基因在影响miR-101调控肝癌细胞生长和迁移能力中的重要作用。研究结果1.miR-101在多种肿瘤中低表达,且其低表达与多种肿瘤的不良预后密切相关,miR-101可以抑制肝癌细胞的增殖和迁移,促进肝癌细胞凋亡,同时引起肝癌细胞的周期阻滞;2.CEP55是miR-101的直接靶向基因,在肝癌细胞过表达miR-101后,CEP55的表达水平降低,干涉miR-101的表达后,CEP55的表达水平升高;3.干涉CEP55后,肝癌细胞的增殖能力受到抑制,凋亡水平升高,有丝分裂时间延长,同时肝癌细胞的体内生长受到抑制,有丝分裂异常细胞的比例增加;4.细胞学实验证实,CEP55可以恢复miR-101对肝癌细胞在体外生长的抑制;动物学实验证实,CEP55可以恢复miR-101对肝癌细胞在体内生长的抑制;5.在肝癌临床样本和细胞系中,miR-101与CEP55在表达水平上呈负相关;6.miR-101可以通过靶向ANXA2、ACLY和DDX3X抑制肝癌细胞的增殖和迁移。研究结论1.CEP55是miR-101下游调控肝癌细胞生长、特别是有丝分裂进程的重要靶分子;2.miR-101可以分别靶向ANXA2、ACLY或DDX3X的表达,抑制肝癌细胞在体外的生长和迁移。