对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒衣壳蛋白基因的原核表达和真核表达以及抗体制备

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对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒病被国际兽疫局(OIE)列为“须向OIE申报的甲壳动物重要疾病”之一[1]。该病毒对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)有较强的致病性,死亡率高达90%,严重将导致慢性矮小残缺综合症(runt-deformitysyndrome,RDS),对红额角对虾(Penaeusstylirostris)的致病性和致死率均较高[2]。   本研究对厦门地区发病对虾检疫中分离得到对虾IHHNV,对IHHNV病毒的主要相关研究如下:   1、IHHNV衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及抗体制备   根据GenBank(NC-002190)IHHNV的全基因组序列,设计出主要结构蛋白基因Ⅳ的相应引物,从厦门发病的对虾中,提取DNA,以此为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因。再将目的基因分别与表达载体pGEX-6p(l)和pET-28a连接,构建重组表达载体(命名为pGEX-Ⅳ、pET-Ⅳ),大肠杆菌BL21中IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测,大小约为62kD和41kD。将pET-Ⅳ表达重组蛋白经纯化,免疫小鼠。Western免疫印迹反应结果表明其抗体均可与pGEX-Ⅳ和pET-Ⅳ表达的蛋白发生特异性反应。   2、IHHNV衣壳蛋白基因在毕赤酵母中的表达及抗体制备   将该病毒主要结构蛋白基因克隆至毕赤酵母穿梭表达质粒pPIC9K,构建重组表达载体(命名为pPIC9K-Ⅳ),酶切线性化后采用电穿孔法转化到毕赤酵母GS115宿主菌。采用PCR方法分析和G418筛选来鉴定重组的毕赤酵母,诱导表达的产物分别进行ELISA分析或Western免疫印迹反应鉴定,分泌表达产物分子量大小为40kD左右,制备的兔抗对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒衣壳蛋白的血清可与真核表达的目的蛋白发生特异性反应。本研究的结果为口岸检验检疫对虾能够快速检测IHHNV提供了研究基础。通过毕赤酵母表达的衣壳蛋白比原核表达的更具有生物活性。
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