缺血性脑血管病是当今危及人类健康和生命的主要疾病之一，然而治疗该病的有效方法相当缺乏。近年来，缺血性脑血管病机制和治疗的研究已深入到基因水平，而研究脑缺血中差异表达的基因及其所编码的蛋白质在脑缺血损伤中的作用，以进一步探索脑缺血损伤的病理生理机制，已成为寻找治疗缺血性脑血管病靶位基因和新途径的热点之一。 本实验室前期工作中利用荧光差异显示RT-PCR(FDDRT-PCR)技术研究了急性脑缺血大鼠中脑缺血区与非缺血区差异表达的基因，得到了一条在脑缺血区明显表达上调的基因，同源性分析发现该基因与人KIAA0280的同源性达95％，与小鼠的达97％，因而命名为大鼠KIAA0280；表达谱分析表明KIAA0280在脑组织中高度表达。为进一步探讨大鼠KIAA0280在其他因素诱导的神经元损伤过程中的表达是否发生变化，其是否在这个过程中发挥促进或抑制神经元损伤的作用，我们建立了神经元凋亡模型，初步探讨大鼠KIAA0280在这些神经元凋亡模型中的表达情况。同时，本课题进行了大鼠KIAA0280的克隆表达和纯化，以获得大量高纯度的蛋白质，用于其后续的抗体制备、晶体结构的预测及其相关功能的研究。 第一章大鼠KIAA0280在神经元凋亡模型中的表达研究本章初步探讨了大鼠KIAA0280在体外谷氨酸诱导的大脑皮质神经元凋亡模型、低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型和缺氧诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型中的表达的情况。 方法：大鼠皮质神经元和小脑颗粒神经元的分离和原代培养；建立谷氨酸诱导的大脑皮质神经元凋亡模型、低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型和缺氧诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型；倒置相差显微镜下观察细胞的形态学改变；二乙酸荧光素(fluoresceindiacetate，FDA)染色检测神经元的代谢活性(metabolicactivity)和存活率(viability)；Hoechst33258染色观察神经元核及染色质的形态变化；用本实验室自制的大鼠KIAA0280多克隆抗体行WesternBlot蛋白免疫印迹法检测大鼠KIAA0280蛋白表达水平。 结果：成功建立了谷氨酸诱导的大脑皮质神经元凋亡模型、低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型和缺氧诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型；大鼠KIAA0280在谷氨酸诱导的大脑皮质神经元凋亡模型中的表达呈持续下降趋势；大鼠KIAA0280在缺氧诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型中的表达呈早期上升后下降的趋势；大鼠KIAA0280在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型中的表达呈上升趋势。 第二章大鼠KIAA0280的克隆表达和纯化本研究首先选用带有His-tag的原核表达载体PQE30，在大肠杆菌中进行了大鼠KIAA0280的克隆表达和纯化，得到了His-KIAA0280融合蛋白的包涵体；随后，为表达可溶蛋白做准备，本实验构建和克隆了大鼠KIAA0280的酵母表达载体pPICZB-KIAA0280，并将其转化入酵母GS115、X-33和KM71H中。 第一节大鼠KIAA0280在大肠杆菌中的克隆表达和纯化方法：PCR扩增大鼠KIAA0280的ORF；TA克隆该基因并酶切鉴定；构建带有His-tag的原核表达载体PQE30-KIAA0280后行酶切、测序鉴定；将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG诱导表达；行SDS-PAGE分析；并用本实验室自制的KIAA0280多克隆抗体进行WesternBlot特异性鉴定；经可溶性分析后，在变性条件下用NI-NTAHis-Bind树脂纯化蛋白质包涵体。 结果：成功构建了原核融合表达载体PQE30-KIAA0280；成功诱导表达了分子量约27KDa的His-KIAA0280融合蛋白质；纯化后得到融合蛋白的包涵体。 第二节大鼠KIAA0280酵母重组表达质粒的克隆和转化方法：PCR扩增大鼠KIAA0280的ORF；TA克隆该基因并酶切鉴定；构建pPICZB-KIAA0280表达载体并行酶切、测序鉴定；将pPICZB-KIAA0280线性化后，电转化入酵母GS115、X-33和KM71H中；然后，我们行PCR分析目标基因是否整合进GS115、X-33和KM71H基因组中。 结果：构建和克隆了酵母融合表达载体pPICZB-KIAA0280，并成功把该重组质粒整合进酵母GS115、X-33和KM71H基因组中。