论文部分内容阅读
目的: 探讨人体细胞核移植来源的兔-人胚胎干细胞(SCNT-rhESCs)体外保持未分化状态的扩增能力及其人胚胎干细胞特性,着重探讨 SCNT-rhESCs 在体外向成骨表型细胞分化的潜能和条件,尝试为骨组织工程探寻一种含有人自体基因、无免疫排斥反应、具有高分化潜能的全新种子细胞。 方法: 应用已建立的人体细胞核移植来源的兔-人胚胎干细胞(SCNT-rhESCs)系体外扩增培养 50 代后,进行系统的干细胞特性鉴定并进行体外成骨定向诱导分化研究。采用机械法收集 SCNT-rhESCs,首先在体外悬浮培养形成含有三个胚层(内、中、外胚层)定向祖细胞的拟胚体(Embryoid body,EB)。7 天后,将拟胚体转入细胞培养板内进行贴壁培养,分组进行成骨定向诱导研究:一组为成骨诱导组,采用含抗坏血酸(50mg/L)、地塞米松 (1×10-8 mol/L)、β-甘油磷酸(10mmol/L)、15%胎牛血清的α-MEM 矿化培养基;另一组为非诱导组,采用仅含 15%胎牛血清的α-MEM 培养基;采用具有成骨能力的胎儿骨髓间充质干细胞(MSC)作为实验的阳性对照。各组细胞均置于 37℃,5%CO2饱和湿度的培养箱培养。采用倒置显微镜适时观测诱导过程中的细胞形态学变化;通过茜素红染色、碱性磷酸酶(Gomori-钙钴法)染色、S-P 法免疫组化及免疫荧光染色检测骨钙素(Osteocalcin, OCN)以及Ⅰ型胶原的表达以鉴定成骨诱导后的细胞表型。 结果: SCNT-rhESCs 在体外扩增培养 50 代后,仍能保持未分化状态并具有人胚胎干细胞特性。表现为:人胚胎干细胞特异性表面标志 SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60等阳性,而鼠胚胎干细胞表面标志 SSEA-1 阴性,细胞核型正常,DNA 微卫星遗传标志分析显示其基因型与供体细胞完全一致,并且 SCNT-rhESCs 可以在体外自发分化形成拟胚体。同时,拟胚体贴壁培养后在成骨诱导剂的作用下 2-3 周时有成骨表型细胞出现,表现为:倒置镜下细胞呈多伪足或鳞片样,能形成茜素红染色阳性的骨结节;成熟成骨细胞标志——碱性磷酸酶染色阳性;S-P 法免疫组化及免疫荧光染色示骨组织中的主要胶原蛋白成分——Ⅰ型胶原以及骨组织中的主要的非胶原蛋白成分、成骨晚期标志物——骨钙素均呈阳性,提示 SCNT-rhESCs 在体外经成骨诱导剂的定向诱导后可以产生稳定的成骨表型细胞。而非诱导组SCNT-rhESCs 则形态各异,在不同时间段内部分自发分化成为神经元样细胞、脂肪样细胞、肌肉样细胞以及其他未定型细胞,未观察到有明显的成骨表型细胞出现。 结论: 1.人体细胞核移植来源的兔-人胚胎干细胞——SCNT-rhESCs 可在体外进行扩增且能保持干细胞的未分化特性和多向分化潜能。 2.同时,在成骨诱导剂的作用下 SCNT-rhESCs 可以分化成为稳定的成骨表型细胞。 因此,由 SCNT-rhESCs 来源的成骨细胞可以作为胚胎早期骨发生、发育的研究模型并可为骨组织工程提供全新的包含人自体基因、无免疫排斥反应的新种子细胞。