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第一部分急性胰腺炎患者血清高迁移率族蛋白B1水平与肠粘膜屏障损伤的关系目的:通过监测血清高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box B1,HMGB1)水平与急性胰腺炎患者肠粘膜屏障损伤的动态变化,探讨HMGB1在急性胰腺炎患者肠粘膜屏障损伤中的作用。方法:选择起病24h内入我院的急性胰腺炎患者59名,根据病情分为轻症急性胰腺炎(Mild Acute Pancreatitis,MAP)26名、中度重症急性胰腺炎(Moderately Severes Acute Pancreatitis,MSAP)17名、重症急性胰腺炎(Severes Acute Pancreatitis,SAP)16名,选择同时期入我院体检的健康者(对照组)20名。分别于患者起病后24h、48h、72h抽取静脉血,采用双抗体夹心免疫发光法(ELISA)测定血清中HMGB1、TLR4(toll-like receptor 4)、TLR9(toll-like receptor 9)、TNF-α(tumor necrosis factor-alpha)、IL-6(interleukin 6)、DAO(Diamine oxidase)水平。结果:1、本实验中MAP、MSAP、SAP组血清中HMGB1、TLR4、TLR9、DAO水平在24h、48h均明显高于对照组(P<0.05),在48h达峰值后逐渐下降。在72h时间点,MAP组血清中HMGB1、TLR4、TLR9、DAO水平与对照组无明显差异(P>0.05),但MSAP、SAP组仍然明显高于对照组(P<0.05)。2、各时间点HMGB1、TLR4、TLR9、TNF-α、IL-6、DAO在各组中的水平依次为MAP<MSAP<SAP,差异具有统计学意义(P<0.05)。3、各时间点,MAP组中TNF-α与对照组无差异;TNF-α在MSAP组24小时升高,48、72小时水平较前降低;TNF-α在SAP组24小时升高,48、72小时仍保持高水平。4、IL-6水平在MAP、MSAP组于24小时升高,48、72小时降低;在SAP组中为48小时水平最高,72小时下降。5、在48h时间点,血清中HMGB1水平与血清DAO明显相关(r=0.942,P<0.05)。结论:HMGB1可能在急性胰腺炎患者肠粘膜损伤的发生发展中发挥作用。第二部分高迁移率族蛋白B1对小鼠急性坏死性胰腺炎肠粘膜屏障损伤的作用及机制研究目的:研究HMGB1在急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis,ANP)小鼠肠粘膜屏障损伤中的作用及可能的机制。方法:本实验采用腹腔内注射13次雨蛙素(50μg/k g)+1次脂多糖(15 mg/kg)诱导小鼠急性坏死性胰腺炎模型。选择使用雄性KM小鼠24只,体重22-25g,完全随机分为4组,6只/组。A组:ANP组。B组:ANP+HMGB1中和抗体组,造模完成后向腹腔内注射抗HMGB1中和抗体(300μg)。C组:ANP+control Ig Y组,造模成功后向小鼠腹腔内注射control Ig Y(300μg/只)。D组:正常对照组。造模前12小时开始禁食,自由饮水。造模完成后12小时处死实验动物,取胰腺、小肠行HE染色后,进行病理学观察。分离血清,使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清中IL-1β,IL-6,TNF-α,DAO和内毒素核心抗体(Endotoxin core antibody,Endo CAb)含量。使用TUNEL检测法观察肠粘膜上皮细胞凋亡,测IOD值。Western blot检测小肠组织中HMGB1、TLR4、TLR9、NF-κB(nuclear factor-kappa B)的表达情况。结果:1、A、B、C组小鼠胰腺HE染色均符合坏死性急性胰腺炎病理表现,第四组小鼠为正常胰腺。与A、C小鼠相比,B组小鼠胰腺病理评分得到改善。2、A、C组小鼠小肠HE染色切片中可见部分小肠绒毛上皮下出现间隙,伴有毛细血管扩张、淤血,炎症细胞浸润,少数可见固有层水肿、出血、炎性细胞弥漫增多。B组小肠病理评分较A、C组有所下降。3、A、B、C组小鼠血清中IL-1β,IL-6,TNF-α,DAO和内毒素核心抗体含量均明显高于第D小组(P<0.05)。B组小鼠血清中上述指标水平明显低于A、C组小鼠(P<0.05)。第A、C组小鼠所检测的血清学指标无明显差异(P>0.05)。4、A、B、C组小鼠肠粘膜凋亡检测的IOD值明显高于第D小组(P<0.05)。B组小鼠IOD值明显低于A、C小鼠(P<0.05)。A、C小鼠的IOD值无明显差异(P>0.05)。5、使用Western blot检测各组小鼠肠道中HMGB1、TLR4、TLR9、NF-κB的表达,A、B、C组小鼠肠道中上述蛋白的表达均明显高于第四小组(P<0.05)。B组小鼠上述蛋白的表达低于A、C组小鼠(P<0.05)。A、C组小鼠检测的蛋白表达无明显差异(P>0.05)。结论:1、HMGB1可能在ANP肠粘膜屏障损伤中发挥作用。2、HMGB1可能通过TLR4、TLR9信号通路使激活NF-κB,从而导致ANP小鼠肠粘膜屏障损害。3、HMGB1中和抗体不仅可能降低ANP时血清中炎症因子的水平,而且可能对ANP肠粘膜屏障损伤起保护作用。