论文部分内容阅读
尼古丁是烟草合成的一种生物碱，是一种有毒N-杂环类化合物。烟草加工过程会产生大量废弃物，因含较多尼古丁，对环境和人类健康造成威胁。使用绿色高效的手段降解尼古丁是处理这种废弃物的重点，现在多使用传统的物理化学方法处理，容易引起对环境的二次污染，微生物法降解尼古丁因其绿色和可持续性成为现在研究的主要方向。经过多年的研究，微生物降解尼古丁的机制被逐渐研究清楚。本实验室前期分离筛选出了一株AgrobacteriumtumefaciensS33，该菌可以尼古丁为唯一的碳源和氮源生长，以一种新的途径——吡咯途径和吡啶途径的“杂合途径”——来降解尼古丁。近年来本实验室对该菌株进行了详细研究，其降解尼古丁的生化机制逐渐清晰，其中与吡啶途径相似的过程是从尼古丁通过两步氧化反应生成6-羟基假氧化尼古丁，进一步通过6-羟基假氧化尼古丁脱氢酶(Pno)的催化生成6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶，该醛中间物的降解与吡咯途径相应的过程相似:从6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶通过两步氧化生成2，5-二羟基吡啶，进一步开环后最后进入TCA循环。
尽管该途径的生化机制已经得到了较多的研究，但其中仍有一些问题未解决。如虽然之前已经对Pno进行了表征，但对其反应还没有完全了解，即反应起始速度很快，随后却迅速下降，导致生成极少量的产物。考虑到6-羟基假氧化尼古丁中具有次级胺基团，推测在反应中产生了不稳定的有毒的代谢物亚胺中间物。有趣的是在尼古丁降解基因簇中存在一个基因，可编码Rid蛋白(命名为Rid-NC)，Rid是一个分布广泛的具有多种功能的小分子蛋白家族，其中一些亚家族具有脱氨酶活性以消除亚胺/烯胺活性中间物的毒性。因此推测Rid-NC蛋白可能与Pno反应不完全的问题相关。除了Pno反应存在的问题，尼古丁降解途径中催化第五步6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶生成6-羟基-3-琥珀酰吡啶的关键酶及催化反应机制也未知。在尼古丁降解基因簇上有一个尚未被研究的ald基因预测编码醛脱氢酶，推测Ald就是催化该步反应的关键酶。
基于上述分析，本论文主要对A.tumefaciensS33尼古丁代谢途径中的关键酶Rid-NC和Ald的生化性质和功能进行了研究。首先对Rid-NC进行了异源表达和纯化，通过向Pno催化的反应(6-羟基假氧化尼古丁脱氢生成6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶)中加入Rid-NC测定酶活变化，发现加入Rid-NC可增强Pno的催化反应。使用假氧化尼古丁代替6-羟基假氧化尼古丁(实验室前期已证实可替代)进行实验，发现Rid-NC依旧可增强Pno的催化反应;并通过实验验证Rid-NC可减轻Pno反应中可能产生的亚胺中间物的毒性，对底物与产物进行HPLC定量分析，发现加入Rid-NC其反应产物量至少增加了5倍。同时，对rid-NC基因的敲除导致菌株S33在尼古丁上生长缓慢。这些证据表明Rid-NC在A.tumefaciensS33降解尼古丁的过程中具有重要作用。对Rid-NC分析发现Rid-NC属于Rid6亚家族，在A.tumefaciensS33基因组上还存在与其同属Rid6亚家族的Rid-AA;进一步对典型的RidA、Rid-AA和Rid-NC进行研究，发现RidA和Rid-AA也具有与Rid-NC的相同功能。通过对Rid-NC保守氨基酸位点突变体进行实验，探讨了Rid-NC与亚胺中间体的反应机制。该实验结果解释了6-羟基假氧化尼古丁氧化为6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶的详细过程。
对Ald进行异源表达纯化后，使用NAD+作为辅酶，通过LC-MS鉴定了Ald可催化6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶生成6-羟基-3-琥珀酰吡啶，并鉴定了使用3-琥珀酰半醛吡啶代替6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶的可行性。对ald基因的敲除导致菌株S33在尼古丁上缓慢生长，表明Ald在A.tumefaciensS33降解尼古丁的过程中具有重要作用。同时还测定了Ald催化3-琥珀酰半醛吡啶、苯甲醛、糠醛和乙醛等不同底物反应的最适pH值和表观Km值。考虑到呋喃类化合物的用途，测试了Ald重组细胞催化糠醛为糠酸的转化效率，发现催化2h底物就已完全转化，催化15h产物转化率达99％，初步证明Ald可用于生物基呋喃化工产品的加工。
本论文通过对Rid-NC的异源表达纯化、酶活测定和性质研究，发现Pno反应中可能存在有毒的亚胺中间物影响Pno活性，Rid-NC通过其脱氨酶活性可减轻其影响，并探究了Rid-NC和有毒的亚胺中间物的反应机制。这一发现进一步加深了对有毒N-杂环芳香化合物在微生物中代谢过程的理解。本研究证明Rid家族蛋白除参与氨基酸代谢外，还参与N-杂环芳香生物碱的代谢，首次验证了Rid6亚家族蛋白在代谢损伤控制系统中的功能。报道了活性亚胺对非5-磷酸吡哆醛依赖酶的损伤能力，该研究为认识Rid蛋白家族的功能提供了新的见解。
通过对Ald的异源表达纯化和酶活测定，证实了Ald以NAD+为辅酶催化6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶生成6-羟基-3-琥珀酰吡啶，并对Ald的底物范围做了测试，Ald重组细胞可有效催化糠醛为糠酸，提供了生物基呋喃化工产品催化的新途径。这些发现解决了A.tumefaciensS33中尼古丁氧化降解的杂合途径中未知的反应机制问题并初步探索了Ald的应用。
尽管该途径的生化机制已经得到了较多的研究，但其中仍有一些问题未解决。如虽然之前已经对Pno进行了表征，但对其反应还没有完全了解，即反应起始速度很快，随后却迅速下降，导致生成极少量的产物。考虑到6-羟基假氧化尼古丁中具有次级胺基团，推测在反应中产生了不稳定的有毒的代谢物亚胺中间物。有趣的是在尼古丁降解基因簇中存在一个基因，可编码Rid蛋白(命名为Rid-NC)，Rid是一个分布广泛的具有多种功能的小分子蛋白家族，其中一些亚家族具有脱氨酶活性以消除亚胺/烯胺活性中间物的毒性。因此推测Rid-NC蛋白可能与Pno反应不完全的问题相关。除了Pno反应存在的问题，尼古丁降解途径中催化第五步6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶生成6-羟基-3-琥珀酰吡啶的关键酶及催化反应机制也未知。在尼古丁降解基因簇上有一个尚未被研究的ald基因预测编码醛脱氢酶，推测Ald就是催化该步反应的关键酶。
基于上述分析，本论文主要对A.tumefaciensS33尼古丁代谢途径中的关键酶Rid-NC和Ald的生化性质和功能进行了研究。首先对Rid-NC进行了异源表达和纯化，通过向Pno催化的反应(6-羟基假氧化尼古丁脱氢生成6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶)中加入Rid-NC测定酶活变化，发现加入Rid-NC可增强Pno的催化反应。使用假氧化尼古丁代替6-羟基假氧化尼古丁(实验室前期已证实可替代)进行实验，发现Rid-NC依旧可增强Pno的催化反应;并通过实验验证Rid-NC可减轻Pno反应中可能产生的亚胺中间物的毒性，对底物与产物进行HPLC定量分析，发现加入Rid-NC其反应产物量至少增加了5倍。同时，对rid-NC基因的敲除导致菌株S33在尼古丁上生长缓慢。这些证据表明Rid-NC在A.tumefaciensS33降解尼古丁的过程中具有重要作用。对Rid-NC分析发现Rid-NC属于Rid6亚家族，在A.tumefaciensS33基因组上还存在与其同属Rid6亚家族的Rid-AA;进一步对典型的RidA、Rid-AA和Rid-NC进行研究，发现RidA和Rid-AA也具有与Rid-NC的相同功能。通过对Rid-NC保守氨基酸位点突变体进行实验，探讨了Rid-NC与亚胺中间体的反应机制。该实验结果解释了6-羟基假氧化尼古丁氧化为6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶的详细过程。
对Ald进行异源表达纯化后，使用NAD+作为辅酶，通过LC-MS鉴定了Ald可催化6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶生成6-羟基-3-琥珀酰吡啶，并鉴定了使用3-琥珀酰半醛吡啶代替6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶的可行性。对ald基因的敲除导致菌株S33在尼古丁上缓慢生长，表明Ald在A.tumefaciensS33降解尼古丁的过程中具有重要作用。同时还测定了Ald催化3-琥珀酰半醛吡啶、苯甲醛、糠醛和乙醛等不同底物反应的最适pH值和表观Km值。考虑到呋喃类化合物的用途，测试了Ald重组细胞催化糠醛为糠酸的转化效率，发现催化2h底物就已完全转化，催化15h产物转化率达99％，初步证明Ald可用于生物基呋喃化工产品的加工。
本论文通过对Rid-NC的异源表达纯化、酶活测定和性质研究，发现Pno反应中可能存在有毒的亚胺中间物影响Pno活性，Rid-NC通过其脱氨酶活性可减轻其影响，并探究了Rid-NC和有毒的亚胺中间物的反应机制。这一发现进一步加深了对有毒N-杂环芳香化合物在微生物中代谢过程的理解。本研究证明Rid家族蛋白除参与氨基酸代谢外，还参与N-杂环芳香生物碱的代谢，首次验证了Rid6亚家族蛋白在代谢损伤控制系统中的功能。报道了活性亚胺对非5-磷酸吡哆醛依赖酶的损伤能力，该研究为认识Rid蛋白家族的功能提供了新的见解。
通过对Ald的异源表达纯化和酶活测定，证实了Ald以NAD+为辅酶催化6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶生成6-羟基-3-琥珀酰吡啶，并对Ald的底物范围做了测试，Ald重组细胞可有效催化糠醛为糠酸，提供了生物基呋喃化工产品催化的新途径。这些发现解决了A.tumefaciensS33中尼古丁氧化降解的杂合途径中未知的反应机制问题并初步探索了Ald的应用。