谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)具有底物谱广、易于培养等优势，被广泛应用于L-谷氨酸、L-赖氨酸等多种氨基酸的工业化生产。本论文旨在通过对C.glutamicum标准菌株ATCC13032及一株L-赖氨酸高产突变菌株中部分中心代谢关键酶进行系统的动力学表征，确定胞内代谢物的抑制类型与抑制常数，为构建酶约束的C.glutamicum基因组规模代谢网络模型，通过反向代谢工程手段构建L-赖氨酸高产菌株提供数据支撑。具体研究对象为磷酸戊糖途径关键酶6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶6-PGDH、三羧酸循环关键酶L-苹果酸脱氢酶MDH与L-赖氨酸合成途径关键酶天冬氨酸激酶AK。
　　L-苹果酸脱氢酶MDH催化的L-苹果酸与草酰乙酸之间的相互转化是TCA循环的关键反应之一，连接着C.glutamicum中多条代谢途径，其催化底物草酰乙酸是L-赖氨酸所属天冬氨酸族氨基酸合成的直接前体。本论文第二章实现了C.glutamicumATCC13032中MDH和L-赖氨酸高产突变菌株中MDHm(272位Thr残基突变为Ile残基)的外源表达和分离纯化，确定MDH和MDHm催化L-苹果酸与草酰乙酸间的可逆转化，但倾向于以NADH作为辅因子催化草酰乙酸转化为L-苹果酸的还原反应。测定了MDH和MDHm以草酰乙酸和NADH为底物时的动力学参数，发现272位Thr残基突变为Ile残基导致MDHm对于草酰乙酸的亲和力提高，对于NADH的亲和力降低。确定了2-酮基戊二酸、ATP、ADP和AMP对MDH和MDHm催化反应的抑制类型与抑制常数，发现MDHm相对标准菌株中MDH，对胞内能量水平响应模式发生改变，MDH受ATP抑制，而MDHm受AMP抑制。
　　6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶6-PGDH是C.glutamicum中磷酸戊糖途径的关键酶之一，催化6-磷酸葡萄糖酸生成核酮糖-5-磷酸与CO2，同时伴随NADPH的生成，有研究表明6-PGDH的突变可以显著提高C.glutamicum的L-赖氨酸生产水平。本论文第三章实现了C.glutamicumATCC13032中6-PGDH和L-赖氨酸高产突变菌株中6-PGDHm(353位Ser残基突变为Phe残基)的外源表达和分离纯化。测定了6-PGDH和6-PGDHm以6-磷酸葡萄糖酸和NADP+为底物时的动力学参数，发现353位Ser残基突变为Phe残基导致6-PGDHm对于6-磷酸葡萄糖酸的亲和力提高，但是催化效率显著降低。确定了果糖-1，6-二磷酸、ATP、NADPH、甘油醛-3-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸对6-PGDH和6-PGDHm催化反应的抑制类型与抑制常数，发现6-PGDH和6-PGDHm受NADPH的显著抑制，但突变前后NADPH的Ki无变化。
　　天冬氨酸激酶AK是天冬氨酸族氨基酸生物合成途径中的第一个限速酶，其活性受L-赖氨酸和L-苏氨酸两种产物的协同反馈抑制，有研究表明，AK突变对于L-赖氨酸的积累具有积极作用。本论文第四章对C.glutamicumATCC13032中AK以及L-赖氨酸高产菌株中AKm(311位Thr残基突变为Ile残基)进行外源表达，发现将His标签置于N末端，仅可实现AK与AKm的α亚基外源表达与分离纯化，而将His标签从N端替换至C端，可实现含α、β亚基的AK与AKm的分离纯化，为后续AK与AKm的动力学表征奠定了基础。