结核病是危害人类健康的重大传染病之一，我国是结核病高发国家。随着抗生素的广泛使用，耐多药结核病(MDR-TB)和严重耐多药结核病(XDR-TB)日益增多。研发更有效的药物治疗结核感染，同时减轻药物的毒性和防止耐药性的产生成为亟待解决的问题。 噬菌体裂解酶作为一种新的抗菌剂走进人们的视野：(1)在体内和体外都有快速有效的抗菌活性。(2)作用于细胞壁粘膜，可以杀死群居的致病菌。(3)一种全新的作用模式，即酶切肽聚糖。(4)较窄的抗菌图谱。(5)几乎不可能形成抗性。(6)明显的安全性。(7)可以通过基因工程的手段简单改造。 噬菌体D29是一种裂解性分枝杆菌噬菌体，它能感染并裂解结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌。本研究对噬菌体D29的裂解酶进行了以下探索： 1.噬菌体D29的生物学扩增与蛋白质分析：液体培养耻垢分枝杆菌及其噬菌体D29，测定噬菌体D29效价为3×108。通过蛋白质同源性分析和功能保守区分析，蛋白gp10与不同裂解酶有30％～50％的同源性，其功能保守区属于裂解酶家族；蛋白gp12与不同裂解酶和角质酶有28％～42％的同源性，基功能保守区属于水解酶家族。同时根据文献报道推测gp10和gp12可能有裂解作用。 2.构建原核表达载体和优化表达目的蛋白：分离噬菌体D29并提取其基因组。以结核分枝杆菌噬菌体D29基因组为模板，设计引物，通过PCR选择性地扩增gene10、gene11、gene12、gene30，与T-载体连接，检验并测序后与表达载体pET42a连接，转化入表达菌株BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，并优化表达条件。最佳表达条件为：30℃，0.5mM IPTG诱导8h，用bandscan软件分析两蛋白表达量分别占总蛋白的32.3％和43.1％。 3.蛋白gp10、蛋白gp10的纯化与复性：蛋白gp10和gp12以包涵体形式表达，降低诱导温度，无法使目的蛋白可溶性表达。8M尿素溶解包涵体，由于蛋白连接有his标签，用镍柱纯化融合蛋白gp10和gp12，咪唑洗脱。用透析复性、稀释复性、柱上固相复性的方法进行复性，均未得到较高的复性率。通过正交分析的方法优化透析的复性缓冲液，在基本缓冲液中加入1nM EDTA，0.1％PEG2000后，进行梯度透析，蛋白gp10和gp12的可溶性复性率可达30％和40％以上，大副提高可溶性蛋白的复性率。 4.蛋白gp10、蛋白gp12生物学活性研究：蛋白gp10和gp12冷冻干燥浓缩后用蒸馏水溶解，过滤除菌。用杯碟法和二倍稀释法检验蛋白10和蛋白12是否有裂解酶活性，并与链霉素、卡那霉素和利福平比较抑菌效果。杯碟法测得1024μg/mL的蛋白gp10在平板上形成了2mm的透明圈，二倍稀释法测得蛋白gp10最低抑菌浓度为128μg/mL，但抑菌效果不如链霉素、卡那霉素和利福平，gp12没有抑菌效果，对gp10也没有辅助作用。 综上所述，本研究成功构建了表达载体pET42a-gp10，pET42a-gp11，pET42a-gp12，pET42a-gp30，重组载体转化进入BL21(DE3)后获得了较高产量的重组蛋白gp10和gp12。蛋白gp10和gp12经尿素变性后纯化，通过优化的复性缓冲液透析复性，得到较高的可溶性复性率。抑菌实验证明，蛋白gp10有较低的裂解酶的作用，蛋白gp12没有裂解酶的作用。本实验为今后结核分枝杆菌D29裂解酶的进一步研究奠定了坚实的基础。