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背景和目的:颌面部骨缺损可由牙外伤、龋病、牙周病以及肿瘤等所引起,是口腔临床医师经常要面对的困境。对于大面积骨缺损的成骨修复,传统的治疗方法包括骨移植、使用人工骨替代材料等,这些方法存在诸多缺点。近年来随着骨组织工程技术的快速发展,该技术中的关键环节生长因子促进种子细胞成骨分化成为了研究热点。寻找能有效促进成骨的生长因子,研制能在局部骨缺损环境中有效释放外源性生长因子的缓释系统,对于颌面部骨缺损的临床治疗具有重要意义。近年来有学者在对骨关节炎的研究中发现,WWP2参与调控了成骨关键因子Runx2的转录活性,而目前对于WWP2能否促进颌面部骨缺损成骨的相关研究报道较少。为了系统的探索WWP2的促成骨效果,我们设计了三个实验,第一是通过体外实验研究WWP2对大鼠前成骨细胞(MC3T3-E])成骨的影响;第二是与材料学合作研制一种含有WWP2的聚苯乙烯微囊,与高分子透明质酸混合制成微囊缓释系统,研究在体外环境中该缓释系统WWP2的缓释效果;第三是通过动物体内实验研究高分子透明质酸负载含WWP2微囊缓释系统对大鼠牙槽骨缺损的成骨作用,为颌面部骨缺损临床治疗提供研究基础。方法:给予实验组MC3T3-E1细胞含有不同浓度WWP2的成骨诱导液刺激(5、10、20、50μμg/ml),给予对照组不含有WWP2的成骨诱导液刺激,第1至第5天采用CCK8检测各组细胞增殖情况,第7、14天采用ALP染色及活性测定检测各组细胞碱性磷酸酶的表达情况,第14天采用茜素红染色检测各组细胞的矿化结节形成情况,第7、14天采用Real-time PCR及Western blot技术检测各组成骨关键因子Runx2、COL-1、Osterix、OCN基因和蛋白的表达,通过结果来检测WWP2对细胞的成骨效果;采用可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合法制备粒径均匀的PSMA-b-PS微球,采用复乳溶剂挥发法将WWP2导入微球制成PSMA-b-PS-HAMA微囊,与高分子透明质酸混合制成WWP2-PSMA-b-PS-HAMA缓释系统,酶联免疫分析法测定微囊的载药率、包封率以及微囊与高分子透明质酸不同混合比例下缓释胶体的体外释放,评价其缓释效果;建立大鼠下颌牙槽骨箱状骨缺损模型,分为实验组、对照组和空白组:实验组在缺损区域加入WWP2-PSMA-b-PS-HAMA,对照组在缺损区域只加入PSMA-b-PS-HAMA,空白组在缺损区不添加任何材料,各组分别于第4、8周处死大鼠,采用micro CT和HE染色评价成骨效果,采用Real-time PCR、Western blot检测成骨关键因子Runx2、COL-1、Osterix、OCN基因及蛋白的表达。结果:观察含有不同浓度WWP2的成骨诱导液对MC3T3-E1细胞成骨的影响,CCK8结果显示:各组MC3T3-E1细胞均生长良好,各组细胞前2天的增殖速率较低,之后增殖速率加快,第5天达到高水平,1 0μμg/ml组OD值最高,与其他组相比具有统计学差异;7天及14天时,各组细胞均呈现ALP 阳B性表达,镜下大体观察10μg/ml及20μg/ml组ALP颜色最深,ALP活性定量结果显示,第7天和第14天时,实验组的ALP活性值明显高于对照组,随着WWP2浓度的升高,ALP活性先升高后降低,10μg/ml组及20μg/ml组中ALP活性值最高;茜素红染色结果显示,第14天时各组均出现红色矿化结节,镜下大体观察1Oμg/ml组矿化结节最多,半定量结果统计分析,各实验组的矿化结节数量明显高于对照组,10μμg/ml组矿化结节最多;第7天和第14天各组Real-time PCR、Wettern blot检测结果显示,各实验组(COL-1、O5t6rix、OCN的mRNA和蛋白的表达均高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),随着WWP2浓度的升高,COL-1、Osterix、OCN的mRNA和蛋白的表达随之升高,进而出现下降,10μg/ml组表达量最高,各实验组间及其与对照比较,Runx2的mRNA及蛋白表达无统计学差异;合成粒径均匀的PSMA-b-PS微球,WWP2包封入PSMA-b-PS制成的微囊粒径直径约1μm,分布均匀,WWP2包封率为76%,载药率为2.5%,微囊与高分子透明质酸按照1:10-1:20重量比例下混合缓释效果较为理想,3天累计释放率约38%,7天累计释放率约60%,释放周期可达到28天以上;micro CT和HE染色结果显示,第4周、8周,实验组成骨效果好于对照组和空白组,新骨形成量多于对照组和空白组;Real-time PCR、Western blot检测结果显示,实验组COL-1、Osterix、OCN基因及蛋白的表达明显高于对照组和空白组,差异具有统计学意义,三组间比较Runx2基因及蛋白表达无统计学差异。结论:WP2对MC3T3-E1细胞具有促成骨作用,能增强COL-1、Osterix、OCN成骨因子的基因及蛋白表达,促成骨效果具有浓度依赖性;WWP2-PSMA-b-PS与HAMA按照一定比例混合制成的微囊胶体具有良好的缓释效果;WWP2能有效促进大鼠缺损牙槽骨的成骨,高分子透明质酸负载含WWP2微囊缓释系统具有临床应用价值。