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梨是我国的传统果品之一,栽培面3积和总产量都居世界第一,但其单产和品质都远低于世界先进国家的水平,严重影响了我国梨的出口和创汇。病毒病害是影响其产量和品质的重要因素,对梨造成了严重的危害。苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)对梨的危害就是典型的实例。ASPV是凹陷病毒属(Foveavirus)的代表种,一种潜隐病毒,主要侵染苹果和梨,只在敏感型的砧木上表现症状,常见症状为死顶、内茎皮坏死、嫁接时衰退、叶偏上性生长等,能导致梨产量明显下降和品质改变,严重影响着梨业的发展。 目前,栽培无病毒苗木是解决梨上ASPV危害的有效途径,病毒检测是培育和繁殖无病毒苗木的重要环节。另一方面ASPV在苹果和梨树中的含量极低,且苹果和梨树组织中含有大量酚类等物质,病毒的分离提纯非常困难,国内还没有能制备用于检测ASPV的抗体。 本研究采用生物学、血清学和分子生物学三种方法对砂梨上的ASPV进行了快速检测方法的研究,并成功地克隆了来源于砂梨样品6-1-13上ASPV的外壳蛋白(Coat protein, CP)基因,对其进行了序列测定、原核表达和western-blot分析,具体研究结果如下: 生物学检测:在温室,将常规PAS-ELISA粗检呈阳性的10个砂梨样品通过汁液摩擦接种草本指示植物西方烟(Nicotiana occidentalis‘37B’),10个样品在西方烟上都产生不规则小斑点,同时6-1-13、6-1-103和4-2-51三个样品产生脉黄症状;通过二重芽接法嫁接木本指示植物,10个样品在杂种棍椁(Pyronia veitchii)上普遍产生叶片反卷、植株矮化、剥开树皮有痘斑的症状,在A20上的症状为叶片上有褪绿叶斑,支脉变黄。结果表明,ASPV采用草本指示植物和木本指示植物检测,症状明显,结果可靠。 血清学检测:采用常规的PAS-ELISA、改进的PAS-ELISA和直接包被抗原ELISA(PTA-ELISA),检测生物学显症的样品,通过将第二抗与酶标A蛋白预反应后混合加入,可降低非特异反应,提高阳性样品和阴性样品的吸光度比值(P/N);常规PAS-ELISA与PTA-ELISA检测的结果一致。对样品6-1-13,采用提取缓冲液等倍稀释研磨,结果表明稀释倍数越低,P/N值越高,检测效果越好,一般5倍左右稀释P/N值较高,结果较稳定。该方法安全可靠、快速准确,适合大量样品的检测。 分子生物学检测:参照已报道的ASPV全基因组核苷酸序列设计合成引物,以芽接显症的杂种楹椁叶片为材料,提取dsRNA为模板,分别对6-1-13、4-2-51、4-1-51、