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目的:PSORI-CM02方源于国医大师禤国维教授治疗银屑病的验方,经卢传坚教授团队不断优化而成,前期研究表明具有显著的临床疗效,且在动物和细胞实验中具有抗炎、抗增殖、免疫调节等作用,但PSORI-CM02方对银屑病免疫病理的启动环节-树突状细胞（Dendritic cells,DCs）的影响尚未开展研究。芍药苷是PSORI-CM02方的主要活性成分之一。本研究采用咪喹莫特（Imiquimod,IMQ）诱导的银屑病动物模型,以及体外培养的树突状细胞模型,观察PSORI CM02方和芍药苷对体内外DCs表型和功能的影响,并观察二者对银屑病小鼠模型的治疗作用,进一步明确PSORI-CM02方及其主要活性成分芍药苷治疗银屑病的作用机制和科学内涵。方法:1.建立银屑病小鼠模型和观察药物治疗效果:将Balb/c小鼠随机分为正常对照组、IMQ组、甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX）组、PSORI-CM02方低和高剂量组（或0.5%和2%芍药苷组）。IMQ软膏涂抹小鼠背部皮肤7天进行银屑病造模,造模过程中隔日测量和评估小鼠体重、红斑、鳞屑、浸润程度和银屑病面积和严重度指数（Psoriasis areas and severity index,PASI）评分,第七天拍照取材,检测脾脏指数、HE染色。2.银屑病小鼠皮肤、淋巴结中DCs及脾脏中T细胞的表达:取背部皮肤进行Siglech蛋白免疫组化染色。流式检测小鼠淋巴结中CD11c+DCs和CD207+DCs表面CD83、CD86、MHCII 的表达,CD207+CD103+、CD207+CCR7+、CD1 1c+IL-12p35+细胞的比例,以及脾脏中 CD4+IFN-γ+、CD4+T-bet+、CD4+IL-17A+、CD4+RORyt+细胞的比例。3.小鼠骨髓来源树突状细胞（Bone marrow dendritic cells,BMDCs）的培养和鉴定:GM-CSF和IL-4诱导培养小鼠骨髓单核细胞6至7天,流式检测CD11c+细胞比例鉴定BMDCs纯度。4.BMDCs的增殖和形态:CCK8检测PSORI-CM02方、PSORI-CM02方和细菌脂多糖（LiPoPolysaccharide,LPS）、PSORI-CM02 方和 IMQ 干预对 BMDCs 增殖的影响。倒置相差显微镜下观察和拍摄PSORI-CM02方、LPS、IMQ干预的BMDCs形态。5.BMDCs的抗原摄取功能:PSORI-CM02方和OVA-FITC干预BMDCs,流式检测细胞中FITC阳性细胞比例。6.BMDCs成熟:LPS或IMQ刺激PSORI-CM02方或芍药苷提前干预BMDCs,流式检测BMDCs表面CD83、CD86、MHCII的表达。7.BMDCs中炎症及趋化因子表达:PSORI-CM02方干预LPS刺激的BMDCs,RT-PCR 检测 IL-12A、IFN-γ、CCL20、TNF、IL-17F 及 IL-23 的表达;PSORI-CM02方干预IMQ刺激的BMDCs,RT-PCR检测IL-12A、IFN-γ及IL-23表达;LPS刺激PSORI-CM02方提前干预的BMDCs,流式检测IL-12p35胞内蛋白的表达;IMQ及芍药苷干预 BMDCs,RT-PCR 检测 IL-1β、IL-6、IL-12A、IL-23、IFN-γ及 TNF 的表达。8.BMDCs调控辅助性T细胞（HelPer T cells,Th）分化:磁珠分选脾细胞中的Na（？）ve CD4+T细胞,药物和刺激剂LPS干预共培养体系（BMDCs和Na（？）ve CD4+T细胞按1:9的比例共培养）,流式检测Th1细胞分化-CD4+IFN-γ+、CD4+T-bet+细胞比例及Treg细胞分化-CD4+CD25+、CD4+CD152+细胞的比例。9.BMDCs中信号通路蛋白的表达:LPS刺激PSORI-CM02方提前干预的BMDCs,Western-blot检测p-Stat3（Ser727）、p-Stat3（Tyr705）、STAT3、p-P38 MAPK、P38 MAPK的表达。结果:1.PSORI-CM02方对IMQ诱导的银屑病小鼠的治疗作用及对DCs的影响A.PSORI-CM02方对银屑病小鼠的治疗作用对动物皮损改善的影响:IMQ软膏可诱导小鼠背部皮肤银屑病样皮损,与人类银屑病皮损相似,PASI评分增高,MTX及PSORI-CM02低、高剂量可改善小鼠银屑病样皮损并降低PASI评分。对动物体重的影响:正常对照组小鼠体重在7天实验过程中具有逐渐上升的趋势;IMQ组、MTX组及PSORI-CM02低、高剂量组小鼠体重与正常对照组小鼠体重相比具有不同程度的下降趋势。对脾脏指数的影响:IMQ组小鼠脾脏指数与正常对照组对比显著增高;MTX组脾脏指数同IMQ组相比显著降低;PSORI-CM02低、高剂量组脾脏指数与同IMQ组对比有下降的趋势,但无统计学差异。对皮肤病理组织学的影响:HE染色结果表明,IMQ组小鼠皮肤出现银屑病样的组织学形态,MTX组及PSORI-CM02低、高剂量组的银屑病样组织学形态改善;表皮垂直厚度结果表明,IMQ组表皮厚度较正常对照组显著增厚,MTX组及PSORI-CM02低、高剂量组较IMQ组对比显著变薄。B.PSORI-CM02方影响IMQ诱导的银屑病小鼠中DCs的分布皮肤浆细胞样树突状细胞（Plasmacytoid dendritic cells,PDCs）的分布:免疫组化染色检测皮肤PDCs的结果（即Siglech 阳性染色面积）表明,IMQ组中Siglech表达较正常对照组显著增多,而PSORI-CM02低、高剂量组及MTX组较IMQ组显著减少。引流淋巴结中具有迁徙功能DCs的分布:流式检测结果表明IMQ组中CD207+CD103+迁徙真皮树突状细胞（Migratory dermal dendritic cells,mDDCs）比例同正常对照组小鼠相比显著增高,PSORI-CM02低、高剂量组及MTX组同IMQ组相比显著下降;IMQ组中CD207+朗格汉斯细胞（Langerhans cells,LCs）表面趋化因子受体7（C-C chemokine receptortype 7,CCR7）的表达比例与正常对照组相比显著增加;PSORI-CM02低、高剂量组及MTX组LCs表面CCR7的表达比例同IMQ组显著相比下降。C.PSORI-CM02方抑制IMQ诱导的银屑病小鼠中DCs成熟流式检测LCs成熟结果表明:IMQ组淋巴结中CD207+CD83+、CD207+CD86+及CD207+MHCⅡ+细胞的比例同正常对照组相比显著增加;而PSORI-CM02低、高剂量及MTX干预后3群细胞比例同IMQ组相比显著下降。流式检测CD1 1c+DCs成熟结果表明:IMQ组淋巴结细胞中CD11c+DCs表面CD83+、CD86+、MHCII+的表达比例与正常对照组相比显著增加;而PSORI-CM02低、高剂量及MTX干预后3群细胞表达比例同IMQ组相比具有下降的趋势。D.PSORI-CM02方干预IMQ诱导银屑病小鼠中DCs调控T细胞的分化流式检测脾脏Th细胞分化结果表明:IMQ组CD4+IFN-γ+、CD4+T-bet+、CD4+IL-17A+、CD4+RORγt+细胞比例与正常对照组相比显著增加;PSORI-CM02低、高剂量及MTX组4群细胞比例同IMQ组相比显著下降。流式检测淋巴结DCs内细胞因子IL-12结果表明:IMQ组CD1 1c+IL-12p35+细胞比例与正常对照组相比显著增加;而PSORI-CM02方低、高剂量及MTX组干预后,该群细胞比例显著下降。2.PSORI-CM02方对BMDCs功能的影响及机制研究A.PSORI-CM02方对BMDCs形态和增殖的影响诱导小鼠骨髓单核细胞6至7天。流式检测鉴定BMDCs纯度结果表明:CD11c+细胞比例可达88.4%。倒置显微镜下观察细胞形态,细胞体积增大,表面形成突起;LPS和IMQ的刺激可促进细胞表面的突起增多变长,PSORI-CM02可抑制细胞突起的形成。CCK8检测PSORI-CM02干预BMDCs增殖结果表明:4、8mg/mLPSORI-CM02大幅度显著抑制BMDCs增殖,0.25至2mg/mLPSORI-CM02小幅度显著抑制BMDCs增殖,0.0625、0.125mg/mLPSORI-CM02对BMDCs増殖没有影响,差异无统计学意义;LPS显著促进BMDCs增殖,而0.5至2mg/mL PSORI-CM02显著抑制LPS诱导的 BMDCs 增殖;IMQ 显著抑制 BMDCs 增殖,而 0.5 至 2mg/mLPSORI-CM02 在 IMQ干预的基础上进一步显著抑制BMDCs增殖。B.PSORI-CM02方抑制BMDCs成熟和抗原摄取功能流式检测BMDCs成熟结果表明:LPS造模组BMDCs表面CD83、CD86、MHCⅡ表达比例与空白对照组对比显著增高,0.5、1、2mg/mLPSORI-CM02显著抑制CD83、CD86表达比例,但显著促进MHCII表达比例;IMQ组BMDCs表面CD83、CD86、MHCⅡ表达比例与空白对照组对比显著增高,0.5、1、2mg/mLPSORI-CM02显著抑制 CD83、CD86、MHCII 表达比例。流式检测BMDCs抗原摄取结果表明:与空白对照组对比,OVA-FITC单独干预组中FITC 阳性细胞比例显著增高,0.5、1、2mg/mLPSORI-CM02显著抑制FITC阳性细胞比例。C.PSORI-CM02方对BMDCs中炎症因子的影响RT-PCR检测BMDCs中细胞因子结果表明:与空白对照组对比,LPS造模组BMDCs 中 IL-12A、IFN-γ、CCL20、TNF、IL-17F 及 IL-23 表达显著增高,除 0.5mg/mL PSORI-CM02 组中的 TNF、IL-17F,各浓度的 PSORI-CM02 可显著下调 IL-12A、IFN-γ、CCL20、TNF及IL-17F的表达,但PSORI-CM02方对IL-23表达的异常增高没有抑制作用,差异无统计学意义。与空白对照组对比,IMQ造模组BMDCs中IL-12A、IFN-γ及IL-23的表达显著增高,各浓度PSORI-CM02可显著抑制IL-12A和IFN-γ表达,2mg/mLPSORI-CM02 可显著抑制 IL-23 的表达,但 0.5、1mg/mLPSORI-CM02 显著促进IL-23表达。流式检测BMDCs中胞内蛋白结果表明:与空白对照组对比,LPS组CD11c+IL-12p35+、CD11c+IFN-y+细胞的比例显著增高;0.5、1、2mg/mLPSORI-CM02给药组中两群细胞的比例显著下调。D.PSORI-CM02方干预BMDCs调控T细胞的分化流式检测CD4+T细胞中胞内蛋白的结果表明:LPS刺激BMDCs和Naive CD4+T细胞共培养体系后,CD4+IFN-γ+、CD4+T-bet+细胞比例显著增高;1、2mg/mLPSORI-CM02组两群细胞比例与LPS组相比显著下降。E.PSORI-CM02方抑制BMDCs中的P38和Stat3信号通路Western-blot检测BMDCs内信号通路的结果表明:与空白对照组对比,LPS刺激BMDCs 后,p-P38 和 p-Stat3（Tyr705）的表达显著增高;而 1、2mg/mLPSORI-CM02 可呈一定剂量依赖性显著下调二者的表达。3.芍药苷对银屑病的治疗作用及对DCs的影响A.芍药苷对IMQ诱导银屑病小鼠的治疗作用和机制动物皮损的改善:MTX组、0.5%和2%芍药苷组的银屑病皮损较IMQ组改善。IMQ组PASI评分与正常对照组相比显著升高;与IMQ组对比,MTX组、0.5%和2%芍药苷组银屑病皮损PASI分显著下降。HE染色结果:IMQ组小鼠皮损具有银屑病样病理组织学表现,而MTX组、0.5%和2%芍药苷组银屑病样病理组织学表现缓解。动物体重结果:实验过程中正常对照组小鼠体重具有逐渐上升的趋势;IMQ组、MTX组、0.5%和2%芍药苷组小鼠体重与正常对照组相比具有不同程度下降趋势,具有统计学差异,MTX组和IMQ组小鼠体重下降趋势最大,而0.5%和2%芍药苷凝胶外用治疗可缓解IMQ导致的体重下降趋势。动物脾脏指数结果:IMQ组小鼠脾脏指数与正常对照组对比显著增高;而MTX组同IMQ组相比显著降低,0.5%和2%芍药苷组同IMQ组对比有下降的趋势,但差异无统计学意义。流式检测淋巴结中CD11c+DCs成熟结果表明:与正常对照组对比,IMQ组CD11c+DCs表面CD83、CD86、MHCII的表达比例显著增高;而0.5%和2%芍药苷不能抑制三群细胞的表达比例,差异无统计学意义,MTX组可下调三群细胞的表达比例。B.芍药苷对BMDCs成熟、分泌细胞因子及调控T细胞分化的影响流式检测BMDCs成熟结果表明:实验分为6组,即空白对照组、IMQ组、芍药苷（5、20、50、100μM）,IMQ组BMDCs表面CD83、CD86的表达与空白对照组对比显著增高,各浓度芍药苷不能抑制BMDCs表面CD83、CD86的表达,差异无统计学意义。RT-PCR检测BMDCs中炎症细胞因子的结果表明:实验分为4组,即空白对照组、IMQ组、50μM芍药苷组和100μM芍药苷组;与空白对照组对比,IMQ造模组BMDCs 中 IL-1β、IL-6、IL-12A、IL-23、IFN-γ、TNF 的表达显著增高,IMQ 造模对TNF表达的影响不显著;与IMQ组对比,5和100μM芍药苷不能抑制上述细胞因子的表达,甚至可显著促进炎症因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-23和TNF的表达。流式检测BMDCs和Na（？）ve CD4+T细胞共培养体系的结果表明:实验分为5组,即空白对照组、LPS组、芍药苷组（5、20、1 00（？）M）,LPS刺激共培养体系中CD4+CD25+、CD4+CD152+细胞比例显著减少,而5、20和100（？）M芍药苷组中2群细胞的比例显著增高。结论:1.PSORI-CM02方对IMQ诱导的银屑病小鼠具有治疗作用,可抑制银屑病小鼠皮损真表皮中PDCs的浸润,影响引流淋巴结中DCs的分布、成熟和迁徙,并抑制银屑病小鼠脾脏中Th1和Th17效应T细胞的分化。2.PSORI-CM02方可抑制体外实验中BMDCs的成熟、抗原摄取能力和炎症因子分泌,如Th1细胞分化相关细胞因子IL-12;并且,在BMDCs和Na（？）ve CD4+T细胞共培养体系中,PSORI-CM02方可抑制CD4+na（？）ve T细胞向Th1细胞分化。提示PSORI-CM02方可能通过影响DCs,进而介导Th1细胞的分化和效应,从而发挥治疗银屑病的作用。3.PSORI-CM02方可抑制LPS激活BMDCs中p-Stat3和p-P38 MAPK蛋白的表达。推测PSORI-CM02方可能通过抑制银屑病DCs中的STAT3和P38 MAPK信号通路,从而抑制下游一系列导致银屑病炎症的免疫病理环节。4.芍药苷对IMQ诱导的银屑病小鼠具有治疗作用,但芍药苷不能抑制引流淋巴结中CD11c+DCs的成熟。5.芍药苷不能抑制体外实验中BMDCs的成熟及其炎症因子的表达,但可调控BMDCs和Na（？）ve CD4+T细胞共培养体系中CD4+na（？）.ve T细胞向Treg细胞分化。推测芍药苷可能通过干预DCs而促进Treg细胞的分化,从而发挥治疗银屑病的作用。